セントロメアを染色体上の一カ所に調節する機構の解明

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K06958
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 佐藤 浩 九州大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (00421313)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: セントロメア / ヒストン / エピジェネティクス / 染色体

研究実績の概要

染色体分配に必須であるセントロメアは、エピジェネティックな機構により可塑的にその形成が制御される。本申請研究はモデル生物である分裂酵母を用いて、このセントロメアがどのようにして染色体上の一カ所に調節されるのかを明らかにするために、その分子機構の解明を行っています。申請者はこれまでの研究において、2本の染色体を融合し、一方のセントロメアが不活性化することにより安定化するシュードダイセントリック染色体を保持する株を確立しており、このセントロメアの不活性化にはヘテロクロマチンやヒストンの脱アセチル化が関与していることを示していました。しかしながら、さらなるセントロメア不活性化因子の存在が示唆され、それにはクロマチンの構造や修飾状態が重要であると考えました。そこで、本研究の目的達成のためには、この不活性化セントロメアのクロマチン状態の解析が必要と考え、クロマチン免疫沈降(ChIP)法を用いて解析を行いました。ヒストンH3およびH4の報告されている複数箇所のアミノ酸に対するメチル化、アセチル化、リン酸化やヒストンH2A、H2Bのユビキチン化に対する抗体を用いた免疫沈降実験を行い、活性と不活性のセントロメア間の比較を行った結果、不活性化セントロメアにおいて特別に増加、もしくは減少がみられるヒストン修飾を検出しました。今回検出された不活性化セントロメアにおけるクロマチン修飾の状態の変化は新規なものであり、セントロメア不活性化機構の解明に重要な手掛かりとなる可能性があります。このヒストン修飾に関わる酵素や調節因子を解明することでその分子機構が明らかになると考え、それら酵素の高発現や遺伝子破壊株における解析を始めています。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の平成２７年度の研究予定において、不活性化セントロメアのクロマチンの構造や修飾を、クロマチン免疫沈降法により調べる事を計画していたため、その研究が遂行できた。そしてそれによって、不活性化セントロメアの特徴的なヒストン修飾が明らかにできたことから、平成２７年度の研究計画はおおむね遂行できたと考えている。当初、別の手法として、遺伝子破壊株を用いたセントロメア数の認識分子の解明を始める予定であったが、上記手法により良い結果が得られため、そちらの解析を優先させて進めることにより研究を進展でき目的が達成できることが考えられた。そのため、遺伝子破壊株を用いた認識分子及び調節経路の解明は平成２８年度以降に行うことを計画している。

今後の研究の推進方策

平成２７年度において、本研究の目的である「セントロメアを染色体上の一カ所に調節する機構の解明」の糸口として、不活性化セントロメアにみられるヒストン修飾の変化を明らかにできた。平成２８年度以降はこの結果を発展させた研究を行うことを計画している。
その研究推進方策として、平成２７年度に調べた修飾以外のヒストンのアミノ酸修飾についての不活性化セントロメアへの局在をさらに調べる。そして、これまでに同定できたアミノ酸修飾については、それぞれの部位に対応するメチル化酵素、脱メチル化酵素、アセチル化酵素、脱アセチル化酵素等及びその調節に関わるタンパク質の破壊や過剰発現を行うことによりセントロメアの再活性化や、本来以外の場所へのセントロメア形成が起こらないかを解析する。アセチル化についてはアミノ酸を置換することにより、アセチル化や脱アセチル化を模したヒストンを発現させて、セントロメアの変化を観察することも計画している。さらに、セントロメアの再活性化の抑制にはヘテロクロマチンが関与しているので、ヘテロクロマチンの形成できないような変異株のバックグラウンドにおける実験も予定している。これらの実験と並行して、ヒストンシャペロンやDNA損傷チェックポイントなどに関わる遺伝子破壊を行い、セントロメア数の認識調節経路の解明を行う。

次年度使用額が生じた理由

平成２７年度中に代表研究者が所属の変更を行ったことにより、研究目的の遂行および研究の進展には大きな影響はなかったものの、計画した分量の実験を行えなかったために、物品・消耗品購入等の計画に変化が生じる結果となり、次年度繰越額(使用額）が発生しました。平成２７年度に計画していたものの実施出来なかった研究(遺伝子破壊実験等)について平成２８年度に実施し、それにかかる試薬や物品の購入にこの次年度使用額を使用します。

次年度使用額の使用計画

平成２７年度にできなかったセントロメア形成に関わるヒストンシャペロン、DNA損傷チェックポイントやその関連遺伝子に対する遺伝子破壊株によるセントロメア再活性化実験を平成２８年度に行う。さらに、当初の計画通り、平成２７年度同定された不活性化セントロメアにみられるヒストン修飾を触媒もしくは抑制する酵素の破壊や強発現誘導を行い、その際のセントロメア形成活性の状態を観察する。また、ヒストンのアミノ酸置換などの実験も計画している。そこでこれら分子生物学的実験にかかわる試薬や酵素、消耗品購入の費用と、研究成果を学会で発表するための旅費として、当初の平成２８年度分の予算と平成２７年度の次年度使用額の使用を計画している。