| 研究課題/領域番号 |
15K06967
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
有吉 眞理子 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 研究員 (80437243)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| キーワード | リン脂質 / 酵素 / 結晶構造 / カルシウム結合ドメイン |
|---|
| 研究実績の概要 |
生体内に存在する多種多様なリン脂質は、細胞内環境を維持する細胞膜の形成、細胞内外の物質輸送、膜タンパク質の局在・活性制御に関与し、シグナル伝達のメディエーターとしての機能も担っている。リン脂質脂肪酸鎖リモデリング経路で働くリゾリン脂質アシル転移酵素群は、これらリン脂質の多様性と恒常性の制御において重要な役割を担っている。本研究では、リン脂質脂肪酸鎖リモデリングの鍵となるアシル転移反応の分子機構の解明に向け、リゾホスファチジルコリンアシル転移酵素LPCAT1の構造機能解析に取り組んだ。
1-アシルグリセロール-3-リン酸-O-アシル転移酵素(AGPAT)ファミリーに属する小胞体膜上に局在するアシル転移酵素であるLPCAT1は、膜貫通領域、AGPATファミリーに共通する3つの配列モチーフを含む触媒ドメインに加えて、２つのEF-handカルシウム結合モチーフを持つ 。H27年度は、それぞれの機能ドメインの結晶構造解析に取り組んだ。第一に、LPCAT1のEF-hand領域の結晶構造を2.4オングストローム分解能で決定し、カルシウム結合による構造変化や機能制御に関わる構造知見を得た。異なる基質に対してカルシウム非依存的なアシル転移活性とカルシウムによる阻害効果を示すが報告されており、これらの知見はLPCAT酵素群の基質特異性や活性機序を理解する上で重要である。また、LPCAT1と同じくAGPATファミリーに属するリゾリン脂質アシル転移酵素であるLPCAT2のEF-hand領域の結晶化にも成功し、X線回折データーを得た。今後、構造決定を行い、LPCAT1とLPCAT2のカルシウム結合能の比較を行う。さらに、LPCAT1の膜貫通領域を除いた領域の大量発現系、試料調製法を確立、結晶化を行い、微結晶を得ている。結晶化条件を最適化し、結晶構造決定を行う予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画通り、LPCAT1のEF-hand領域の結晶構造解析は順調に終了し、バイオインフォーマティクス解析や生化学的解析から、本酵素のカルシウム結合に関する知見を得た。触媒ドメインのみのタンパク質試料は可溶性が低く、構造解析のターゲットとして不向きであることがわかったため、膜貫通領域を除いた領域の発現、精製へと方針を変更し、その結果、微結晶が得られている。まだ、結晶化条件の改善が必須であるが、概ね順調に進んでいるものと考える。基質認識および触媒機構を明らかにするために、NMR, X線小角散乱 (SAXS)など、X線結晶解析以外の構造生物学、物理化学的な手法を利用し、さらに効率的に研究を進めていくことが可能である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
第一に、LPCAT1とLPCAT2のEF-hand領域、および全長のカルシウム結合能の比較、また、触媒活性へのカルシウム依存性を検証する。
また、膜貫通ドメインを除いた触媒ドメインとEF-hand領域を含む領域の微結晶を得ているので、結晶化条件の最適化を行う。結晶が得られたら、Ｘ線回折データーを収集、立体構造を決定する｡高分解能の結晶が得ることが困難な場合、Ｘ線小角散乱法 (SAXS)による低分解能での溶液中での構造解析を行うことも視野に入れ、どのようにして2つの機能ドメインが協調的に触媒活性の制御をおこなっているのか、また、カルシウム濃度に依存した活性制御に関する構造知見を得る。さらに、活性部位変異体等を用いて、基質であるリゾホスファチジルコリンと脂肪酸-CoAとの複合体の調製、結晶化を行い、より高分解能での結晶構造解析を試みる。得られた構造から、アシル転移反応のカルシウム依存性、EF-hand領域による活性制御の可能性を検証し、酵素反応機構モデルを提唱することが可能である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度の前半は、主として、LPCAT１のEF-hand領域の結晶構造解析、およびその結果に基づくデーター情報解析を、後半は、タンパク質試料調製を中心に行った。X線構造解析に必要なプログラムやコンピューター、精製に用いる機器等はすでに研究室に設置済みであり、ほとんど実験にかかる備品、高額の消耗品を購入する必要がなかった。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
H27年度からくりこした研究費は、次年度以降に行う基質との結合実験や組換え実験にかかる試薬の購入に充てる予定である。構造知見に基づいた生化学的解析や細胞生物学的解析に新規の試薬、実験器具等が必要になるのでその購入費として使用する予定である。また、LPCAT1の膜貫通領域を除いた領域については、結晶化条件の検討を広範に行う必要があり、結晶化スクリーニングキットや結晶化器具の購入に充てる。放射光実験施設（つくば、もしくは播磨）におけるX線回折データー収集の機会が増えるため、H28年度の出張旅費が増える見込みである。
|
