精神疾患リスク遺伝子産物の構造生物学的研究

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K06980
• 研究機関: 法政大学
• 研究代表者: 雲財 悟 法政大学, 生命科学部, 准教授 (60336592)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: X線結晶構造解析 / シグナル伝達

研究実績の概要

変異によって精神疾患を発症するリスクが高くなる遺伝子は、「精神疾患リスク遺伝子」と呼ばれる。代表的な精神疾患リスク遺伝 子産物synGAPの機能を、構造生物学の手法(X線結晶構造解析、超遠心分析など)で調べて、精神疾患発症メカニズム解明に貢献する 。SynGAPは脳神経細胞内でRap1bのシグナルON・OFFスイッチ機能をコントロールするという重要な役割を果たしている。両者はどのよ うに結合して機能発揮しているのか、相互作用解析や、SynGAPとRap1bの複合体のX線結晶構造解析などを行って解明する。
Rap1bの結晶構造解析に成功した。GDP結合型Rap1b、そしてGTPのアナログであるGppNHp結合型Rap1bの高分解能結晶構造解析に成功し、基質の違いによってRap1bのタンパク質部分がどのように構造変化するかを詳細に知ることが出来た。この構造変化はRap1b のシグナルON・OFFスイッチ機構そのものである。また、このON構造とOFF構造の間の平衡を調節しているアミノ酸残基を特定することに成功した。実際にこのアミノ酸残基を置換すると、構造変化の平衡をシフトさせることができた。Rap1bをはじめとしたGTPase型タンパク質は、その分子進化の過程でシグナルON・OFFスイッチ機構に関わる最適なアミノ酸残基が選ばれていると考えられる。
Rap1bとSynGAPを混合することでRap1bのGTPase活性が上昇する現象を測定する実験を進めている。SynGAP側の特定のアルギニン残基がRap1bのGTPase活性上昇に重要な役割を果たしていることを確認した。synGAPの特定の箇所のリン酸化修飾によるRap1b活性調節機構について検討している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

RRap1bとsynGAPの複合体結晶構造解析を目指している。Rap1bの高分解能結晶構造解析に成功した。GDP結合型Rap1b、そしてGTPのアナログであるGppNHp結合型Rap1bの高分解能結晶構造解析に成功し、基質の違いによってRap1bのタンパク質部分がどのように構造変化するかを詳細に知ることが出来た。
マラカイトグリーン発色を利用したRap1bのGTPase活性測定系を確立した。Rap1b単独ではGTPase活性は弱いが、SynGAPを混合することによって飛躍的に活性が強くなる。SynGAP中のアミノ酸残基で、特定のアルギニン残基が特に重要な役割を果たしていることを確認した。一方、天然型SynGAPに近い長さを持つ長鎖型SynGAPの調製を試みている。synGAPの特定の領域がリン酸化されることでSynGAPによるRap1b活性機構が調節されることが最近判明したため、グルタミン酸残基やアスパラギン酸残基を疑似リン酸化残基に見立てる手法で、変異型SynGAPの調製を試みている。

今後の研究の推進方策

Rap1bとSynGAPの複合体結晶構造解析を目指す。引き続き、Rap1bと安定な結合を示すsynGAPを探索する。発現調製するsynGAPの「長さ」を調整する。また、リン酸化型synGAPの調製 や、疑似リン酸化型synGAPの調製を試みて、Rap1bと安定な結合を示すsynGAPを探索する。良いものが得られ次第、Rap1bとsynGAPの複合体の結晶化スクリーニングを行う。

次年度使用額が生じた理由

タンパク質精製行程および結晶化行程に若干の遅れがある。それらに必要な消耗品を次年度に購入する。

次年度使用額の使用計画

タンパク質精製および結晶化のために必要な消耗品を購入する。

研究成果

• [国際共同研究] University of Edinburgh(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: University of Edinburgh
• [雑誌論文] Molecular Landscape of the Ribosome Pre-initiation Complex during mRNA Scanning: Structural Role for eIF3c and Its Control by eIF5. (2017)
  • 著者名/発表者名: Obayashi E, Luna RE, Nagata T, Martin-Marcos P, Hiraishi H, Singh CR, Erzberger JP, Zhang F, Arthanari H, Morris J, Pellarin R, Moore C, Harmon I, Papadopoulos E, Yoshida H, Nasr ML, Unzai S, Thompson B, Aube E, Hustak S, Stengel F, Dagraca E, Ananbandam A, Gao P, Urano T, Hinnebusch AG, Wagner G, Asano K.
  • 雑誌名: Cell Rep. 巻: 18(11) ページ: 2651-2663
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2017.02.052
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Oligomerization of Hmo1 mediated by box A is essential for DNA binding in vitro and in vivo. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kasahara K, Higashino A, Unzai S, Yoshikawa H, Kokubo T.
  • 雑誌名: Genes Cells. 巻: 21(12) ページ: 1333-1352
  • DOI: 10.1111/gtc.12449
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of MytiLec, a galactose-binding lectin from the mussel Mytilus galloprovincialis with cytotoxicity against certain cancer cell types. (2016)
  • 著者名/発表者名: Terada D, Kawai F, Noguchi H, Unzai S, Hasan I, Fujii Y, Park S-Y, Ozeki Y, Tame JRH.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 6 ページ: 28344
  • DOI: 10.1038/srep28344
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural insight into photoactivation of an adenylate cyclase from a photosynthetic cyanobacterium. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ohki M, Sugiyama K, Kawai F, Tanaka H, Nihei Y, Unzai S, Takebe M, Matsunaga S, Adachi S-I, Shibayama N, Zhou Z, Koyama R, Ikegaya Y, Takahashi T, Tame JRH, Iseki M, Park S-Y.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A. 巻: 113(24) ページ: 6659-6664
  • DOI: 10.1073/pnas.1517520113
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Molecular mechanism of the triplex DNA-binding protein to recognize triplex DNA (2016)
  • 著者名/発表者名: Kazuki Kikuchi, Kohta Sugiyama, Ryotaro Kishi, Satoru Unzai, Hidetaka Torigoe
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27