| 研究課題/領域番号 |
15K06982
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| 研究機関 | 武蔵野大学 |
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研究代表者 |
桑迫 香奈子 武蔵野大学, 薬学研究所, 講師 (10568736)
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| 研究分担者 |
坂本 泰一 千葉工業大学, 工学部, 教授 (40383369)
吉村 明 武蔵野大学, 薬学研究所, 講師 (70302164)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | mRNAスプライシング / NMR |
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| 研究実績の概要 |
さまざまながん細胞において，スプライシング因子SF3b1の特定のリジン残基に集中的に変異が生じていることが報告されてきている。しかし，これらのリジン残基が実際どのようにスプライシングに影響し，がん化と関わっているのかは未知である。本研究は，構造生物学的手法によってSF3b1のリジン残基の役割とその変異がスプライシングに与える影響を明らかにすることを目的としている。
本年度は，まず大腸菌を宿主とした遺伝子組み換えによるSF3b1タンパク質の発現系を検討した。SF3b1の機能発現に重要と考えられる領域（がん細胞で集中的に変異が生じているリジン残基を含む）をGSTタグに融合させた形で発現させ，GSTのアフィニティークロマトグラフィーで1段階精製した後，プロテアーゼによるGSTタグの切除を行ったところ，多くのSF3b1が沈殿してしまった。そこで，SF3b1が水溶液中で安定に存在できる条件を検討している。また，コンストラクトの変更も計画している。さらに，相互作用解析や立体構造解析に向けて,より多くのSF3b1タンパク質を得るためにタグの種類や宿主大腸菌の種類なども検討している。
SF3b1はmRNA上のブランチ部位に結合するU2 snRNPの構成因子であり，紫外線架橋法によって非特異的なRNAと相互作用が報告されている。しかしながら，特異性の有無はこれまでに調べられていない。そこで，SELEX法による最適結合配列の探索を目指している。本年度は，SF3b1タンパク質の結合に十分と考えられる長さのRNAライブラリーをT7 RNAポリメラーゼを用いて作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画では平成27年度中に遺伝子組み換えSF3b1タンパク質の調製法を確立する予定であったが，まだ確立できていない。大腸菌を宿主とし，GSTタグを融合した形での発現には成功したが，GSTのアフィニティークロマトグラフィーで1段階精製した後，プロテアーゼによるGSTタグの切除を行ったところ，多くのSF3b1が沈殿してしまった。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在，SF3b1が水溶液中で安定に存在できる条件を検討している。今後は，性質を変えるためにコンストラクトの変更を計画している。また，相互作用解析や立体構造解析に向けて,より多くのSF3b1タンパク質を得るためにタグの種類や宿主大腸菌の種類なども検討している。
どうしても上手くいかない場合は，タグを付けたまま調製することも検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本来は平成27年度中に遺伝子組み換えSF3b1タンパク質の調製法を確立し，これを用いて機能解析を進める予定であった。しかしながら，現在，遺伝子組み換えSF3b1タンパク質の調製法を検討しており，機能解析には着手できていない。そのため，機能解析に必要となる消耗品の購入費は次年度に使用したいと考えている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成28年度に遺伝子組み換えSF3b1タンパク質の調製法を確立でき次第，機能解析のために数mg単位で調製し，機能解析を行うための消耗品を購入する予定である。
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