がん発症に関わるスプライシング因子SF3b1の構造生物学的研究

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K06982
• 研究機関: 武蔵野大学
• 研究代表者: 桑迫 香奈子 武蔵野大学, 薬学研究所, 講師 (10568736)
• 研究分担者: 坂本 泰一 千葉工業大学, 先進工学部, 教授 (40383369) ; 吉村 明 武蔵野大学, 薬学研究所, 講師 (70302164)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: mRNAスプライシング / NMR

研究実績の概要

さまざまながん細胞において，スプライシング因子SF3b1の特定のリジン残基に変異が生じていることが報告されてきている。しかし，これらリジン残基が実際どのようにスプライシングに影響し，がん化と関わっているのかは未知である。本研究は，構造生物学的手法によってSF3b1のリジン残基の役割とその変異がスプライシングに与える影響を明らかにすることを目的としている。
本年度も引き続き大腸菌を宿主としたSF3b1タンパク質の発現系の検討を行った。SF3b1の機能発現に重要と考えられる領域（がん細胞で集中的に変異が生じているリジン残基を含む）を含むいくつかのコンストラクトで，N末端にGSTやMBPなどのタグを付加して発現させたところ，発現はするものの，不溶化してしまった。SF3b1はタンパク質複合体の一つのサブユニットなので，SF3b1と結合する別のサブユニットとの共発現も行ったが，可用性画分にSF3b1を含む複合体を得ることができなかった。
SF3b1はmRNA上のブランチ部位に結合するU2 snRNPの構成因子であり，紫外線架橋法によってブランチ部位の両側（RNA配列が保存されていない領域）に結合すると報告されている。しかしながら，特異性の有無はこれまでに調べられていない。そこで，SELEX法による最適結合配列の探索を目指している。SF3b1の調製に苦戦しているので，本年度は，ブランチ部位に結合する別のサブユニットを用いて，SELEXを行い，強く結合する配列があるかを調べている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

遺伝子組み換えによるSF3b1タンパク質の調製に苦戦している。さまざまなコンストラクトとタグの組み合わせを試したり，SF3b1はタンパク質複合体のサブユニットなので別のサブユニットとの共発現を試したりしたが，可用性画分にSF3b1を得ることができなかった。

今後の研究の推進方策

SF3b1を可用性画分に得られるように，3つ以上のサブユニットの組み合わせでの共発現を検討している。また，SF3b1と相性が良いサブユニットを探すために，無細胞タンパク質合成系の利用も考えている。

次年度使用額が生じた理由

本来であれば遺伝子組み換えSF3b1タンパク質を調製し，これを用いて機能解析する予定であった。しかしながら，遺伝子組み換えSF3b1タンパク質の調製に苦戦しており，機能解析に着手できていない。機能解析に必要となる消耗品は次年度以降に使用したいと考えている。

次年度使用額の使用計画

遺伝子組み換えSF3b1タンパク質を調製でき次第，機能解析を行うための消耗品を購入する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Solution structure of the first RNA recognition motif domain of human spliceosomal protein SF3b49 and its mode of interaction with a SF3b145 fragment. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kuwasako K, Nameki N, Tsuda K, Takahashi M, Sato A, Tochio N, Inoue M, Terada T, Kigawa T, Kobayashi N, Shirouzu M, Ito T, Sakamoto T, Wakamatsu K, Guntert P, Takahashi S, Yokoyama S, Muto Y.
  • 雑誌名: Protein Sci. 巻: 26 ページ: 280-291
  • DOI: 10.1002/pro.3080.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] In vitro selection of RNA aptamers to a splicing factor. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takuya Yanagisawa, Kanako Kuwasako, Ryo Amano, Yutaka Muto, Taiichi Sakamoto
  • 学会等名: 18th Annual Meeting (21st Annual Meeting of the RNA Society)
  • 発表場所: Kyoto International Conference Center
  • 年月日: 2016-06-29 – 2016-06-29
  • 国際学会
• [学会発表] Solution structures of the two RNA recognition motif (RRM) domains of the human spliceosomal protein SF3b49. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kanako Kuwasako, Kengo Tsuda, Mari Takahashi, Atsuko Sato, Naoya Tochio, Makoto Inoue, Takaho Terada, Takanori Kigawa, Naohiro Kobayashi, Mikako Shirouzu, Takuhiro Ito, Taiichi Sakamoto, Nobukazu Nameki, Kaori Wakamatsu, Peter Guntert, Seizo Takahashi, Shigeyuki Yokoyama, Yutaka Muto
  • 学会等名: 18th Annual Meeting (21st Annual Meeting of the RNA Society)
  • 発表場所: Kyoto International Conference Center
  • 年月日: 2016-06-29 – 2016-06-29
  • 国際学会