研究課題
大腸菌などのグラム陰性菌では、栄養素やタンパク質毒素コリシンを細胞外から内へ輸送する分子機構を備えている。鉄などの生命活動に必須な金属、糖質、ビタミンB12は、外膜にあるレセプターを通過しペリプラズムを経て細胞質に取り込まれる。これらの外膜レセプターからペリプラズムへの物質の輸送に必要なエネルギーは、細胞内膜のプロトンチャネルExbB-ExbD-TonB複合体を介して、細胞質膜内外に生じるプロトン駆動力(Proton motive force; pmf)により供給される。本研究では、ExbB-ExbD-TonB複合体の構造解析から、内膜プロトンチャネルから外膜レセプターへのpmfの供給機構を解明することを目指している。大腸菌のExbB-ExbD(膜貫通領域のみ)複合体の結晶構造は、2016年に報告され(Celia et al, 2016 Nature)、5量体のExbBと1個のExbDからなる複合体であることが明らかになったが、本研究で今年度ExbB-ExbD複合体結晶の2.8 Å分解能までのフルデータセット測定し、明らかになった構造は、ExbBからなる6量体であり、まったく異なる複合体を構成していた。これらの結果は、結晶化条件(主にpH)の影響ではないかと考え、高分解能低温電子顕微鏡と電子線直接検出型の高速読み出しカメラで動画撮影によるデータ収集を行い、ExbB-ExbD複合体の低温電子線単粒子像解析による構造解析を同時に進めた結果、pH依存的に5量体のExbBと6量体のExbBが混在することが明らかになった。約7Å分解能の三次元構造は、6量体のExbBの中央に3個のExbDが非対称に結合していた。これらの結果から、ExbB-ExbD複合体の開閉機構は、ExbBが5量体から6量体へスイッチすることで、行われていること、この機構がpH依存的であることが示唆された。
1: 当初の計画以上に進展している
これまでExbB-ExbD複合体の大量発現系の構築、精製と結晶化、大型放射光施設SPring-8でのX線回折実験を行ってきたが、結晶に異方性があり、構造解析に至ってはいなかった。そこで、蛋白質の精製、界面活性剤、結晶化の条件を広範に探索し、100μm程度の平板結晶を得ることができた。この結晶からSPring-8のビームラインBL41XUにおいて、2.8Å分解能までのデータ測定し、構造を決定することができた(論文審査中)。さらに低温電子顕微鏡の単粒子解析では、pHの異なる溶液中でのExbB-ExbD複合体の構造解析を進めた。低温電子顕微鏡像は、電子線直接検出型のカメラで高速撮影したフレーム間の動きを補正し、ベイズ統計と最尤法を利用した画像解析を進めた。アメリカのカリフォルニア大学サンフランシスコ校、イギリスDiamond Light Sourceの電子顕微鏡センター、理研横浜研究所の電子顕微鏡システムを用いて、多数の高品質の画像を取得することができた。二次元画像のクラス分けを結果から、5量体ExbBと6量体ExbBの混在が明らかになり、その量比はpHにより異なっていることが明らかになった(論文審査中)。以上のように該当年度の研究進捗は大きかったといえる。
X線と電子線による構造解析の結果、ExbB-ExbD複合体は5量体ExbB と6量体ExbBの二状態をpH依存的に変換していることが明らかになった。これらの構造は、いずれも界面活性剤中であったが、大腸菌の脂質から生体膜を作製し、ExbB-ExbD複合体の二次元結晶化をおこなったところ、局所的に二状態が存在していることがわかった(論文審査中）。この二状態に活性があるのかイオンコンダクタンスの測定を行い明らかにする。この測定は、福井大学医学部分子生理学研究室の清水啓史講師の協力のもと進める。また、生体膜中で作製した二次元結晶中に局在する5量体ExbBと6量体ExbB二状態のダイナミクスを直接観察するために高速AFM測定を金沢大学高速バイオAFM応用研究ユニットの柴田幹大ユニットリーダーの協力のもと進める。電子線の単粒子解析で、複合体の二状態の初期三次元構造の計算とそれを基にしてより高い分解能の構造を得るべく画像データの収集および解析を理化学研究所放射光科学総合研究センターの米倉功治主任研究員と共同研究を進める。さらに電子線回折から、プロトン通路等の荷電状態の可視化を目指す。ExbB-ExbD複合体の場合、SPring-8ビームラインでの高分解能フルデータ収集には、放射線による損傷が避けられないため100μm程度の結晶が必要であった。このサイズの良質な結晶を得るためには、3年間の精製条件、結晶条件などの探査が必要であったが、さまざまな結晶条件下で、5 μm以下の針状結晶が多く得られていた。放射光ビームラインではフルデータ収集が困難な微小結晶(5 μm以下)をX線自由電子レーザー(XFEL:X-ray Free-Electron Laser)の短い照射時間(10フェムト秒)で回折パターンを検出する連続フェムト秒結晶構造解析(SFX)を行い、より高分解能の構造決定を目指す。
すべて 2016
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 1件)
J. Appl. Cryst.
巻: 49 ページ: 1517-1523
http://dx.doi.org/10.1107/S1600576716011274
Sci. Rep.
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10.1038/srep25745
