| 研究課題/領域番号 |
15K06987
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
柊元 睦子 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, 上級研究員 (30321756)
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| 研究分担者 |
村山 和隆 東北大学, 医工学研究科, 准教授 (40400452)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | X線結晶解析 |
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| 研究実績の概要 |
RhoファミリーGタンパク質の活性化因子であるRhoGEFタンパク質の大多数は、Gタンパク質のグアニンヌクレオチド交換反応を担うDH-PHあるいはDHR2ドメインといった触媒ドメインに加え、他の複数の機能ドメインを持っている。そのため、上流シグナルによるRhoGEFタンパク質活性化のメカニズム解明においては、触媒ドメインと他の機能ドメインも含めたマルチドメインタンパク質としての解析が極めて重要である。そこで本研究では、RhoGEFタンパク質の立体構造を全長またはマルチドメインタンパク質の状態でＸ線結晶構造解析ならびにＸ線溶液散乱測定により解析し、その活性化制御機構の解明を目指す。
今年度はDockファミリーのRhoGEFタンパク質に対して、DHR2ドメインを中心に複数の領域の発現系を構築し、各試料の発現と精製方法を検討した。その結果、安定に発現するDockタンパク質の領域と発現条件を見出した。今後は、結晶化用試料の調製ならびに基質となるRhoファミリーGタンパク質（Rac1やCdc42）との複合体の結晶化へと進めると同時に、得られた試料のGEF活性、基質結合実験等の生化学的実験を行う。また、これまでに構造決定したDock2やDock4のDHR2ドメインの立体構造に基づいた変異体を設計し、変異タンパク質の生化学的解析を行った結果、GEF活性と基質認識に重要なアミノ酸残基を同定することができた。
DblファミリーのRhoGEFでは、これまでに様々のDH-PHドメインおよびそれ以外のドメインを含む領域について大腸菌無細胞合成系での発現スクリーニングを行った。その結果、マルチドメインタンパクとしてIntersectin2やEct2などで高純度な試料調製が可能となった。これまで検討した複数のコンストラクトの中から会合や分解のない性質の良いコンストラクトの検討・選択を行い、研究を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題で対象とするDblファミリーおよびDockファミリーのRhoGEFタンパク質について、大腸菌無細胞合成系、昆虫細胞/バキュロウイルス系・HEK細胞等の発現系により複数のコンストラクトの発現、精製を検討した。その結果、それぞれのファミリーのRhoGEFタンパク質について、全長またはマルチドメインタンパク質の状態で安定に調製可能なコンストラクトを見出している。
また、これまでに決定したDockファミリーGEFドメインの立体構造に基づいた変異体解析により、GEFメカニズムの分子機構解明に関する重要な知見を得ている。
これらの進捗状況から、本研究課題は当初計画通り概ね順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに調製したDblファミリーおよびDockファミリーのRhoGEFタンパク質について、順次、結晶化用の試料調製および構造解析を実施する。また、X線溶液散乱法によるタンパク質分子動態も考慮した構造解析にも着手する。
結晶化に関して、微小結晶は出るが、構造解析可能な回折像を与える結晶が得られない場合には、さらなる発現領域の改変も検討する。また、単独では結晶化に適した安定したサンプルが得られないターゲットの場合には、制御ドメイン等に結合する他の因子の共存下での試料調製を検討する。
溶液散乱の測定においては、単分散状態の安定なサンプルの調製が非常に重要であるため、安定性と単分散性を十分に評価した上で測定を実施していく。
立体構造から得られた知見を、順次、生化学的・分子生物学的解析を行って検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度に使用したタンパク質発現用の培地・試薬は、研究代表者の所属する研究室の試薬手配のタイミングの兼ね合いで、既に在庫していた試薬を充てて実験を行ったため、当該助成金が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度は、本年度に研究室在庫品から使用した分の培地・試薬を補充購入するともに、当初計画通り、タンパク質の発現・精製・結晶化等の構造解析用の消耗品を納入するために使用する。
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