| 研究課題/領域番号 |
15K06997
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
奥村 宣明 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (20224173)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ペプチダーゼ / ジペプチド / カルノシン / 酵素反応 |
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| 研究実績の概要 |
生体内には種々のジペプチドが存在し、蛋白質の分解や消化における最終段階の中間体として、また、カルノシンなど生体内で合成される機能的ペプチドとして、タンパク質代謝、アミノ酸代謝をはじめとする体内環境の恒常性維持に重要な役割を担っている。近年、ジペプチド分解酵素、カルノシン合成酵素、ジペプチド輸送体などが同定され、ジペプチドの機能解析が進展してきた。私たちはカルノシンを分解するジぺプチダーゼCN2を同定し解析を行ってきたが、最近、これがカルノシン以外にも特定のジペプチドを明確な基質特異性を持って分解することを見出した。本研究は、ジペプチドの蛋白質代謝や恒常性維持機構における重要性を探ることを目的として、基質ペプチドの解析を中心として研究を行っている。
これまでの解析から、CN2や近縁のCN1は、それぞれ多くの種類のジペプチドのうちの一部しか分解しないこと、またその基質特異性が反応条件によって左右されることがわかっている。本年度は、既に前年度に確立した活性測定法を用いて、精製したリコンビナントCN2の各種ジペプチドを分解する活性を種々の条件で比較し、N末端側、C末端側のアミノ酸の種類と活性との関連を明らかにした。また、その活性を速度論的に解析し、反応機構との関連を考察した。さらに、哺乳類細胞にCN2とその近縁のCN1を細胞内に発現させ、活性を測定するとともに、CN1は培地に分泌させて回収し、それらの生体内における活性や基質特異性を推察するとともに、CN1とCN2の活性の比較い、CN1とCN2の機能の違いについて考察した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
この研究を進める上での一つのポイントは活性測定法であるが、現在、予定していた通り活性測定法を確立して、それを用いて解析を進めている。これについては問題はないが、測定に時間がかかり、速度論などの詳細な解析が困難なため、できれば改善したいと考えている。もう一点は、CN1、CN2の発現系で、特にCN1については大腸菌からの精製が困難であったため、今回は哺乳類細胞の発現系を試み、解析することができたが、精製標品は少量しか得られていないため、精製酵素の調製は依然として検討が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
CN1、CN2の基質特異性については、現在行っている活性測定法と蛋白質発現法にさらに改良を加え、速度論ほかの詳細な解析を行うことによって、基質特異性の分子的基盤を明らかにする予定である。また、これらによってCN1、CN2の基質となるジペプチドの範囲が明らかになると考えられるが、それがジペプチドならびにジペプチダーゼの生理機能といかなる関連があるかを検討し、細胞等を用いた実験によりその関連を検証したいと考えている。
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