| 研究課題/領域番号 |
15K07008
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| 研究機関 | 盛岡大学 |
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研究代表者 |
成田 新一郎 盛岡大学, 栄養科学部, 教授 (30338751)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 細胞内タンパク質分解 / 表層ストレス応答 / 細菌細胞表層 / プロテアーゼ / シャペロン / 外膜タンパク質 / ジスルフィド結合 / タンパク質間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
グラム陰性細菌の外膜は抗生物質や界面活性剤などの異物に対して効果的な透過障壁として働き、細菌の生育に必須である。外膜が機能を発揮するには、βバレル構造を持つ外膜タンパク質が正しく組み込まれる必要がある。BepAはグラム陰性細菌のペリプラズム空間に存在するタンパク質であり、外膜タンパク質のアセンブリーを促進するシャペロンとして働くとともに、アセンブリーに失敗した外膜タンパク質を分解するプロテアーゼとして働く。BepAはペプチダーゼM48ファミリーに属するメタロプロテアーゼであり、アミノ末端側にプロテアーゼドメイン、カルボキシル末端側にtetratricopeptide repeat (TPR)ドメインを持つ。TPRドメインは一般にタンパク質間相互作用に関与することから、BepAもこの領域で基質と相互作用することが考えられる。BepAのTPRドメインを構成する全ての残基に対応するコドンを一つずつアンバーコドンに置換した変異体をコードするプラスミドセットを作製し、アンバーサプレッサーtRNAと変異型アミノアシルtRNA合成酵素を利用してこれらのコドンに対応する位置に光架橋性非天然アミノ酸パラベンゾイルフェニルアラニン (pBPA)が導入されたBepA変異体を大腸菌細胞内で発現させ、365 nmの近紫外光を照射することにより、アミノ酸残基レベルの空間分解能でBepAと他因子との近接部位を決定するとともに、それらの因子の同定を行うことにより、BepAと基質との相互作用の様式を明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までの解析により、BepAが外膜タンパク質の生合成に関わるBAM複合体や、リポ多糖の輸送に関わるLptDと相互作用することが示唆された。本年度は、これらの相互作用に影響を及ぼすBepAのアミノ酸残基を変異解析により探索するとともに、構造情報に基づき相互作用部位をマッピングすることにより、BepAの機能に重要な領域を明らかにすることができた。このため本研究課題はおおむね順調に進展していると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
パルスチェイス実験により、BepAがBAM複合体やLptDとどのように相互作用するかを追跡する。また、精製BepAタンパク質を用いたin vitro解析系を構築し、BepAのプロテアーゼ活性がどのように制御されているかを解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画ではpBPAを導入したBepAを発現する大腸菌を大量培養するための恒温振とう培養器の購入を検討していたが、効率的なBepAのin vitro解析系を構築するためにプレートリーダーの導入を優先したため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
BepAの精製とプロテアーゼ活性の測定に必要な試薬の購入に充てる。
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