| 研究課題/領域番号 |
15K07013
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| 研究機関 | 立教大学 |
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研究代表者 |
山田 康之 立教大学, 理学部, 教授 (80386507)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | アロステリック / 調節 / 共役 / 架橋 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度に引き続き、好熱菌（Bacillus PS3）ATP合成酵素の脱共役状態でのサブユニット間相互作用について、サブユニット間架橋による共役の回復、Biacoreによる結合測定の準備を進めた。
サブユニット間架橋については、昨年度検討したγ-ε間架橋だけではなく、ε-c間の架橋についても検討した。その結果、作製した変異体において、架橋の形成は確認できたが、架橋による共役の回復は観察されなかった。この結果から、脱共役状態ではγの回転を伴わないATP加水分解が起こっている可能性と架橋部位が不適切であった可能性が考えられた。そこでこれらの可能性を検討するために、β-γ間を架橋することで、γサブユニットが回転できなくなる変異体を作製し、架橋状態でのGTP加水分解活性を検討した。その結果、γが回転しない状態では、GTP加水分解活性は見られなかった。このため、ε-c間の架橋をした変異体では、架橋導入位置が不適切であったために共役の回復が見られなかったものと考えた。さらに架橋部位の検討を行う予定である。
また、Biacoreでの解析のためにcサブユニット単独での発現系からのcリングの調製を試みたが、発現が不安定であったため、a,b,cサブユニットを含むFoの発現系から調製することとした。報文を参考に精製を試みたが、cリングの単離ができなかったため、精製条件の検討を行う予定である。
この他、脱共役に直接関与するεサブユニットへのATP結合能が変化した種々の変異体を作製、解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
分子内架橋による解析は当初の予定通り進んでいる。また、得られた結果から作業仮説についても検討を行い、当初のモデル以外のモデルもあわせて検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
分子内架橋による検討を更に進めるとともに、Biacoreによるサブユニット間相互作用の解析、脱共役状態におけるプロトン漏洩の解析などを進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Biacoreでの測定に必要なcサブユニットリングの調製ができていないため、当初の予定より支出が少なくなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
cサブユニットリングの調製条件を確立し、それを用いたBiacoreでの測定を行う。
その他、変異体の作製、調製、測定など生化学的な実験を行う。
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