| 研究課題/領域番号 |
15K07018
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
佐藤 秀明 久留米大学, 医学部, 准教授 (60271996)
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| 研究分担者 |
東元 祐一郎 久留米大学, 医学部, 教授 (40352124)
杉島 正一 久留米大学, 医学部, 准教授 (30379292)
原田 二朗 久留米大学, 医学部, 講師 (10373094)
塚口 舞 (古澤舞) 久留米大学, 医学部, 助教 (40624094) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ヘム生合成 / X線結晶構造解析 / 酵素反応 / 阻害剤 / ポルフィリン |
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| 研究実績の概要 |
ポルフィリン生合成経路においては，ヒドロキシメチルビランシンターゼ（HMBS）の合成する鎖状テトラピロールであるヒドロキシメチルビラン（HMB）が，ウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ（UROS）によって環化されてウロポルフィリノーゲンIIIとなる。本研究課題では，HMBSによる4分子のポルホビリノーゲン（PBG）から1分子のHMBへの縮合過程と，UROSによるD環ピロールの反転を伴うHMBの環化過程について，詳細な反応機構の解明を目的とする。今年度は，おもに構造生物学的な手法によって研究を行った。
HMBSについては，その補因子の先に反応を進行させないPBG類似体をひとつだけ結合させた反応中間体のES1型と，ビリルビン等の鎖状テトラピロールを結合させたES4型の複合体の結晶を調製し，大型放射光施設SPring-8のビームラインBL44XUを用いてX線結晶構造解析を実施した。PBG類似体とヒトHMBSのES1型複合体については立体構造を解析することができ，PBG類似体が補因子の近傍に結合してHMBS反応を阻害することを明らかにした。これはHMBSの活性部位に最初の基質が結合する状況を模倣したものと考えられ，HMBSの反応機構を考察する上での重要な情報を得ることができた。一方，ビリルビン等との複合体については良質な単結晶を得ることができておらず，構造解析には至らなかった。
またUROSについては，反応の進行しない基質類似体として鎖状テトラピロールのビリルビン等とヒトUROSとの複合体の結晶化を試みたが，これまでのところ構造解析に用いることのできる良質な単結晶を得ることはできていない。今後さらなる結晶化条件の検討が必要である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究分担者の一人が産前産後の休暇および育児休業を取得したことに伴って，当該分担者が担当していた酵素の発現・精製，酵素活性の解析などを研究代表者が代わりに実施することにしたが，想定したようには進行しなかった。また，HMBSおよびUROSについて，酵素と基質類似体との複合体の結晶構造解析を進めるにあたり，良質の単結晶がなかなか得られなかった。このようなことから，研究の進行に若干の遅れが生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
HMBSの酵素-基質類似体複合体のX線結晶構造解析については，ピロールが複数個連結したES2～ES4型に対応する複合体の立体構造をそれぞれ解析して，HMBSの基質結合部位の構造を明らかにしていく。また，活性部位周辺のアミノ酸残基について縮合反応における役割を探るため，それらの残基に関する変異酵素を作成して活性解析を行う。そして，4分子のPBGがHMBSの活性部位で連結していく過程を詳しく検討する。
一方，UROSについては，基質であるHMBの類似体を調製し，HMB類似体結合型UROSの結晶化および構造解析を進める。得られる立体構造から基質結合に関わると予想されるアミノ酸残基を推定して，それらの残基に関する変異酵素を構築し，反応速度論解析によってこれらの残基が基質結合や触媒活性に果たす役割を調べる。HMBの環化反応に必要と考えられるプロトンの供与体となる残基を明らかにして，UROSがD環ピロールの反転したウロポルフィリノーゲンIIIを合成する過程について詳細に検討する。
これらの実験の結果に基づいて，ポルフィリン生合成経路のHMBSとUROSによって，4分子のPBGからHMBを経て1分子のウロポルフィリノーゲンIIIが合成される過程の反応機構を詳しく考察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度の早い時期から研究分担者の一人が産前産後の休暇ならびに育児休業を取得した。またHMBSとUROSのそれぞれについて，酵素と基質類似体の複合体の結晶化がなかなかうまくいかなかった。このようなことから実験の進行に若干の遅れが生じ，その分だけ今年度の助成金に残金が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度後半には当該研究分担者が育児休業から復帰する予定となっており，次年度はHMBSやUROSの酵素-基質類似体複合体の結晶構造解析を継続して行うとともに，両酵素の変異体の構築や活性解析など，当初の計画に沿った研究を進めていく。これらの研究を遂行するために，今年度の助成金の残金と次年度分として請求した助成金とを合わせて使用する予定である。
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