| 研究課題/領域番号 |
15K07019
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
西井 亘 国立研究開発法人理化学研究所, 横山構造生物学研究室, 研究員 (30287461)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | AAA+プロテアーゼ / 結晶構造 / レドックス制御 / 腸内細菌科 / アロステリックジスルフィド結合 |
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| 研究実績の概要 |
Lonプロテアーゼは，細胞内タンパク質の品質の管理，および機能と寿命の制御に関与する，AAA+プロテアーゼである．Lonプロテアーゼの活性は，細胞にとって諸刃の剣であり，生育環境に応じて厳密に制御される必要がある．しかし，そのメカニズムは多くの点で不明である．申請者はこれまでに，腸内細菌科細菌のLonプロテアーゼが，分子表面のアロステリック・ジスルフィド結合により，腸内外の酸化還元（レドックス）環境の違いに応じて制御されることを報告している．本研究は，この新規のメカニズムの詳細を，分子，細胞レベルで解明することを目的としている．
2015年度は，第一に，大腸菌由来LonプロテアーゼのX線結晶構造解析に向けて，結晶スクリーニングを行った．Lonプロテアーゼの全長立体構造は未知であるが，本研究では，アロステリック・ジスルフィド結合を形成する酸化型，形成しない還元型のいずれについても，X線結晶構造解析に十分と思われるサイズ・形状の結晶を得ることに成功した．さらに，これらの結晶について，大型放射光施設において，中程度の分解能の回折データセットを取得した．現在，これらの回折データを解析するとともに，各種実験条件を最適化しているところである．第二に，アロステリック・ジスルフィド結合による機能制御メカニズムの詳細を解明するため，各種変異型大腸菌Lonプロテアーゼを作製し，その酵素学的・タンパク質科学的性状を解析した．今後，これらの結果を併せて検討することで，Lonプロテアーゼの分子メカニズムを解明できると考えている．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究では，大腸菌Lonプロテアーゼのレドックス制御機構について，（１）X線結晶構造解析によりその構造基盤を明らかにすること，（２）酵素学的・タンパク質科学的性状の詳細を解明すること，（３）生理的意義の詳細を，細胞・個体レベルでの実験から検討すること，を目的としている．
現在までの進捗状況として，（１）については，アロステリック・ジスルフィド結合を形成する酸化型，形成しない還元型のいずれについても，解析に十分と思われるサイズ・形状の結晶を得ることに成功した．さらに，これらの結晶について，大型放射光施設において，中程度の分解能の回折データセットを取得することができた．これらの結果は新規性・重要性が極めて高く，今後の成果を大いに期待することが出来る．（２）については，各種変異型Lonプロテアーゼを調製し，それらの酵素学的・タンパク質科学的性状解析を進行中である．（３）については，当初の予定通り，2016年度以降，実施する予定である．
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までの成果をもとに，今後以下のように研究を推進する予定である．
第一に，大腸菌LonプロテアーゼのX線結晶構造解析に関し，現在までに取得した，アロステリック・ジスルフィド結合を形成する酸化型，形成しない還元型それぞれのX線回折データの解析を進めるとともに，さらに高分解能のデータ取得に向けて，各種実験条件を最適化する予定である．第二に，各種部位特異的変異型Lonプロテアーゼの酵素学的・タンパク質科学的性状をさらに詳細に解析するとともに，X線結晶構造解析の結果と互いに参照して，Lonプロテアーゼの機能発現・制御の分子メカニズムを検討する予定である．第三に，腸内細菌科細菌におけるLonプロテアーゼのレドックス制御の生理的意義を，細胞レベルでの実験から，詳細に検討する予定である．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2015年度は，研究実施計画中の，X線結晶回折実験が大きく進展したため，特にこの実験に集中して研究を実施した．そのため，2015年度に使用予定であった，酵素学的，タンパク質科学的実験に要する費用を，2016年度に繰り越すこととした．
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| 次年度使用額の使用計画 |
2016年度は，X線結晶構造解析を進展する一方，当初2015年度に実施予定であった，酵素学的，タンパク質工学的実験を実施し，さらに2016年実施予定の細胞レベルでの機能解析実験に着手する．これら実験に要する費用として，当初の研究計画書における計上額と昨年度からの繰越金を充当する，
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