| 研究課題/領域番号 |
15K07025
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| 研究機関 | 金沢工業大学 |
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研究代表者 |
辰巳 仁史 金沢工業大学, バイオ・化学部, 教授 (20171720)
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| 研究分担者 |
早川 公英 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60467280)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | アクチン線維 / 切断 / AIP1 / コフィリン |
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| 研究実績の概要 |
細胞の移動や形づくりに、そして細胞の力刺激に対する応答において、アクチン線維の分解とそれにつづく再重合が必須であることが知られている。アクチン線維の分解にはコフィリンに加えてAIP1が重要な役割を持つと推定されているが、その役割や仕組みは不明な点が多い。本研究では、アクチン線維、AIP1、コフィリンを蛍光ラベルし一分子可視化する。ライブイメージングにより、AIP1一分子がコフィリンの結合したアクチン線維に結合しアクチン線維の切断を促進していることを示しAIP1のアクチン線維切断における役割と仕組みを明らかにする。また、AIP1のアクチン線維切断促進作用はアクチン線維の張力により抑制される可能性を検討し、張力依存的に進行する活発なアクチン線維の切断においてAIP1が中心的な役割を持つことを明らかにする。
本研究では、アクチン線維、AIP1、コフィリンを蛍光ラベルし、近接場蛍光顕微鏡（TIRF）でイメージングすることで、アクチン線維一本とAIP1一分子を可視化する。その画像を低ノイズCCDカメラでタイムラプス撮影する。その画像から、AIP1一分子がコフィリンを結合したアクチン線維一本に結合し、その後、アクチン線維が切断されることを画像として捉える。このデータからAIP1一分子（あるいは複数分子）がコフィリンによる切断を促進していることを示す。また切断の後のAIP1の振る舞いを分析することで、切断後アクチン線維の切断端にAIP1が結合する可能性を検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
コフィリンの存在下で一本のアクチン線維にAIP1一分子が結合しアクチン線維の切断が起きるまでの分子の動きを低雑音近接場蛍光学顕微鏡（TIRF）でタイムラプスイメージング（30ms間隔）を行い、その画像分析することができた。
一分子観察のためにAIP1は緑の蛍光色素Alexa488でラベルする。ローダミンを結合したアクチン分子、ビオチン化アクチンを含むアクチンモノマーを重合させてアクチン線維を得る。抗ビオチン抗体をカバーガラスにつけ、アクチン線維をとびとび状にカバーガラスに固定することができた。このようにして用意したアクチン線維はガラスの表面で揺らいでおり、コフィリンやAIP1が溶液中と同様に結合することが期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞レベルの実験から、AIP1のアクチン線維に対する結合あるいは切断活性は、アクチン線維の張力に依存して制御されている可能性が高い。そこで、アクチン線維の内在張力を変化させつつ、AIP1の結合頻度の変化を調べる研究を行う。アクチン線維をカバーガラスに結合し、微小ガラスピペットをガラス表面に沿ってスライドすると、アクチン線維束が形成される。ピペットの位置を変え、アクチン線維束の内部張力を変化させながら、同時にAIP1のアクチン線維束への結合をイメージングする。このような実験を推進する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験機器の購入予定額が僅かに研究費の残額を超えたので次年度に購入予定となったためである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記機器の購入により使用予定である。
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