| 研究課題/領域番号 |
15K07053
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| 研究機関 | 九州工業大学 |
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研究代表者 |
大坪 義孝 九州工業大学, 大学院生命体工学研究科, 准教授 (00380725)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ヘミチャネル / 傍分泌 / 味蕾構造 / 細胞間情報伝達 / パッチクランプ |
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| 研究実績の概要 |
味を感じる感覚細胞（味蕾細胞）の多くは、神経伝達物質を周囲にまき散らす方法（傍分泌）によって、味情報を伝搬する。従って、傍分泌で放出された神経伝達物質は、本来の標的神経細胞に加え、近傍の細胞や神経終末までも刺激することになる。本研究では、味蕾という細胞集団の構造と機能に注目し、味蕾内における味蕾細胞および神経終末の空間配置と細胞ネットワークを用いた味応答の生成機構の関係を解明することを目的としている。
２７年度の研究実施計画では、舌後部中央および舌後部両側に分布する味蕾（味覚器の構成単位）について、単一味蕾に含まれる細胞数および味覚受容に重要な役割を果たすⅡ型、Ⅲ型細胞数を定量的に調べること、傍分泌に関わるイオンチャネルの薬理学的性質を明らかにすることを予定していた。舌後部に分布する味蕾の定量的解析および舌前方の味蕾との比較により、味蕾の最大断面積の大きさや、Ⅲ型細胞の密度、Ⅱ型細胞マーカー分子の共発現率などは、味蕾の存在する部位により異なることを明らかにした。
傍分泌に関与するイオンチャネルの薬理学的性質についての研究は、電気生理学的測定法と色素の取り込み実験で行った。傍分泌に関与するイオンチャネルは、味蕾細胞に数種類発現していると報告されている。近年報告されたイオンチャネルのブロッカーを用いて、電気生理学的に抑制効果を調べたところ、味蕾細胞に発現するイオンチャネルの性質は、イオンチャネルを強制発現させた実験系で得られたイオンチャネルの薬理学的性質と異なることを明らかにした。色素の取り込み実験でも、同様の結果が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
２７年度の実施計画では、①舌後方部に分布する味蕾について、単一味蕾に含まれる各細胞型の細胞数の定量的解析、②舌前方に分布する味蕾細胞に発現するイオンチャネルの薬理学的性質解明を目的としていた。①に関しては、免疫組織学的手法を用いて細胞型特異的マーカーで味蕾を染色し、味蕾全体を共焦点レーザー顕微鏡で撮影後、単一味蕾に含まれる細胞型数を定量的に解析した。その結果、単一味蕾に含まれる各細胞型の割合は、味蕾の存在部位（舌前方や舌後方）によって異なることを明らかにした。Ⅱ型細胞のマーカー分子は数種類存在する。こられⅡ型細胞マーカーの共発現率も部位によって異なることも明らかにした。現在、多少の追加実験を行いながら、論文投稿の準備中であり、目的は達成できたと考えた。
②に関しては、パッチクランプ法と色素の取り込み実験によって、近年報告された傍分泌チャネルの薬理学的性質を調べた。両実験手技でも同様の結果が得られ、味蕾細胞に発現するこのイオンチャネルの性質は、イオンチャネルを強制発現させた実験系で得られたイオンチャネルの薬理学的性質と異なることを明らかにした。また、このイオンチャネルの発現割合についても調べ、このチャネルは一部のⅡ型細胞に発現する可能性を示唆した。現在、追加実験を行いながら、論文投稿の準備中であり、概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
２７年度の研究目的がおおむね順調に進展しているので、当初の研究計画に従って引き続き研究を推進する。２８年度は、単一味蕾細胞にホールセルパッチクランプ法を適用して色素を注入し、その標本を細胞型マーカー分子で染色することで、単一味蕾細胞の形態観察と細胞型の同定を行う。神経線維のマーカー分子の免疫染色を行い、神経終末と味蕾細胞の味蕾内位置関係を明らかにする。また、ATP受容体であるP2X2は味神経に発現しているので、P2X2の発現と各細胞型との味蕾内位置関係も解明する。
同一味蕾に存在する二つの味蕾細胞にそれぞれ異なる色素を注入し、隣接する細胞同士の形状の観察を行う。パッチクランプ法を用いて色素を注入するので、色素注入時に測定する電位依存性電流の特徴から細胞型を予想し、適宜細胞型マーカーを使い分けて実験を行う。注入する色素はバイオサイチンとルシファーイエローを用い、細胞型マーカー分子との三重染色画像を共焦点レーザー顕微鏡で観察する。得られた連続画像をもとに、三次元再構成を行い、2細胞間の形態特徴を観察し数値化する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
パッチ電極をマイクロマニュピュレーションするために新規にマイクロマニピュレーターを購入予定にしていたが、二つの味蕾細胞に同時に色素を注入する実験まで進まなかったので、次年度に購入する予定である。また、国際学会参加を予定していたが研究データが不十分だったため、次年度に参加予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前年度に購入できなかったマイクロマニピュレーターを購入し、味蕾細胞への色素注入実験を行う予定である。国際学会での発表（アブストラクト提出済、参加登録済）を行う予定である。神経線維染色用の抗体および細胞型マーカーの抗体（一次抗体）と二次抗体を購入する。また、単一味蕾細胞に色素を注入する実験では、測定した味蕾細胞の電位依存性電流から細胞型を予測し、予測した細胞型マーカーを用いて免疫染色を行う。そのため、一標本に対して一回の測定しか行うことが出来ないので、実験動物代としてその他経費が必要となる。
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