| 研究課題/領域番号 |
15K07054
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
菊池 浩二 熊本大学, 生命科学研究部, 助教 (70457290)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | Wnt/平面内細胞極性経路 / 微小管結合蛋白質 / Dvl / ゲノム編集 / 前後極性 / 平面内細胞極性 |
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| 研究実績の概要 |
Wntシグナル経路のひとつであるWnt/平面内細胞極性（planar cell polarity：PCP）経路は、細胞運動時に観察される前後極性や上皮組織における上皮細胞の配向パターン（PCP）を制御することで、器官形成に関与する。Wnt/PCP経路は、細胞骨格のダイナミクスと相互的に協調して機能すると考えられているが、その詳細は明らかでない。私共は、細胞骨格の中でも微小管に着目し、微小管ダイナミクスとWnt/PCP経路の連関について、培養細胞を用いて解析し、微小管結合蛋白質のひとつであるMap7とそのパラログであるMap7D1（Map7/Map7D1とする）のノックダウン細胞が、Wnt/PCP経路の構成因子群のノックダウン細胞と同様の表現型（細胞運動能と細胞接着能の低下）を示すことを見出した。Map7/Map7D1はWnt/PCP経路の構成因子であるDishevelled （Dvl）と内在性レベルで複合体を形成し、PCPの形成に必須であるDvlのDEP領域を介して直接的に結合した。また、Dvlは細胞運動時に先導端の細胞表層に集積するが、Map7/Map7D1ノックダウンによりその集積が消失した。Map7-EGFPノックインHeLa細胞を用いたMap7の動態解析から、Map7が微小管プラス端方向に移動することが明らかになり、前述の知見と合わせて、Map7/Map7D1がDvlを細胞表層へ輸送する可能性が示唆された。
Wnt/PCP経路は上皮組織におけるPCPの形成に必須であるが、PCPを形成する培養細胞株は存在しない。そこで、Map7/Map7D1のPCPへの関与を、ショウジョウバエ蛹・翅を用いて解析した。ショウジョウバエMap7ホモログ・Ensconsin（Ens）は近‐遠位軸に沿って偏在化して局在し、Ensノックアウトにより上皮細胞の配向性に異常が認められたため、EnsがPCPの形成に関与することが明らかになった。
培養細胞・ショウジョウバエの解析結果から、Map7/Map7D1はWnt/PCPシグナル経路においてDvlの局在を制御し、前後極性やPCPの形成に関与すると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
ゲノム編集技術によりノックイン細胞やノックインショウジョウバエを作製したことで、内在性レベルでの蛋白質の蛍光イメージングが可能となり、これまでの技術では解析不能であった現象を捉えることができ、詳細な分子メカニズムの解明につながった。
また、本研究から派生して、Map7と同じファミリーに属するMap7D2が脳特異的に発現することに着目し、神経分化におけるMap7D2の機能解析を実施したところ、Map7D2が神経突起の進展を抑制する因子である可能性が示唆された。
本研究成果の一部については、第67回日本細胞生物学会大会とBMB2015にて学会発表を行った（学会発表の項参照）。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの進捗状況を踏まえ、以下の研究を実施する予定である。
（１）Ens-EGFPノックインショウジョウバエを用いた固定サンプルでの免疫染色により、Ensが近‐遠位軸に沿って偏在化して局在することが明らかになった。そこで、live cell imagingによるEns-EGFPの動態解析を実施し、Ensの偏在化の詳細を明らかにする。
（２）ショウジョウバエを用いた解析結果を踏まえ、哺乳類におけるPCPの形成においても機能が保存されているか否かを明らかにすべく、PCPを形成するマウス・卵管上皮においてMap7とMap7D1の細胞内局在（近‐遠位軸に沿った偏在化の有無）を確認する。
（３）本研究から派生して、表現型解析からMap7D2が神経突起の進展を抑制する因子である可能性を見出した。また、Map7D2は分化誘導により活性化するCdk5によってリン酸化を受け、リン酸化型Map7D2は微小管との結合能が低下した。そこで、質量分析装置によりMap7D2のリン酸化部位を同定し、非リン酸化型及び疑似リン酸化型変異Map7D2の過剰発現による神経突起進展への影響を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究の進行にあたって、当該年度の予算は概ね執行しており（執行率99.6%）、繰越額は次年度の予算と合算の上、物品費に充てる予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本研究では下記に示す消耗品が大量に必要となるため、繰越額は次年度の予算と合算の上、物品費に充てる
①哺乳類動物細胞を培養する際に使用する大量の牛胎児血清や培地、培養用器具、②タンパク質の発現やsiRNAによるノックダウンに使用するトランスフェクション用試薬、③ウエスタンブロットや免疫染色法といった生化学的及び細胞生物学的手法に必須である、抗体等、④siRNA等の核酸合成受託サービスの費用
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