| 研究課題/領域番号 |
15K07064
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
木村 誠 国立研究開発法人理化学研究所, 今本細胞核機能研究室, 専任研究員 (00290891)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | キーワード / 核輸送 / importin / プロテオミクス / SILAC |
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| 研究実績の概要 |
多くの核蛋白質は、必要に応じて核－細胞質間を移行する。蛋白質は核膜上の核膜孔を通過して核－細胞質間を移行するが、その多くは輸送因子による媒介を必要とする。ヒトに20種類存在するimportin-βファミリー蛋白質は、代表的な核－細胞質間輸送（核輸送）因子である。そのうち12種類は細胞質から核内への輸送（2種類は両方向の輸送）を担うimportinであり、数千種の蛋白質の輸送を分担すると考えられる。細胞分化や環境変化に応じたimportinの発現調節や修飾による機能調節が多く報告され、輸送される基質蛋白質の核局在の変化が細胞の生理的変化を誘導すると考えられる。核輸送の生理的な機能の解明には、個々のimportinに輸送される基質蛋白質を出来るだけ多く知る必要があるが、その報告は少ない。本研究は、12種類のimportinの輸送基質蛋白質を研究代表者が確立した基質同定法であるSILAC-Tp法により合計1千種以上同定し、その情報に基づいた核輸送の生理的機能の研究方法を確立することを目的とする。前年度には、12種類のimportinについて、それぞれ３回のSILAC-Tp法による基質同定実験を行い、それぞれのimportinについて間違いの少ない少数の（High Specificity）基質候補蛋白質、及び、取りこぼしの少ない（High Sensitivity）相当数の基質候補蛋白質を選定した。今年度は、これらの基質候補蛋白質の多くが実際にimportinと結合することを組換え蛋白質結合実験により確認した。また、同定された基質蛋白質のデータベース解析により、各importinの基質蛋白質群がもつ特徴的な機能を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SILAC-Tp法は、SILAC法による培養細胞の安定同位体アミノ酸（Heavy）標識、in vitro核輸送系による標識透過性細胞の核内への非標識（Light）核抽出液中の蛋白質の輸送、質量分析法（LC-MS/MS）によるLight/Heavy比の定量に基づく輸送された蛋白質の同定で構成される。前年度には12種類のimportinについてSILAC-Tp法による基質同定実験をそれぞれ3回行ない、予定通りデータを得た。1回の実験で測定値（Light/Heavy比）の得られた蛋白質数は期待通り2千を超え、過去に報告された基質の多くは高いLight/Heavy比を示した。一部のimportinでは、過去に数個から数十個の基質報告例があり、これらの蛋白質の測定値を基に設定した基質候補蛋白質の選別方法により、それぞれのimportinについて50～60個程度の確実性の高い（High Specificity）基質候補蛋白質、250～300個程度の擬陽性基質も含む可能性があるが取りこぼしの少ない（High Sensitivity）基質候補蛋白質を選別した。これらの個数は当初目標の同定数に近い。今年度は計画に従い、これら基質候補の組換え蛋白質100種類以上とimportinの組み合わせ200組以上での試験管内結合実験（bead halo assay）を行い、同定結果の妥当性を確認した。また同時に、蛋白質/遺伝子データベースを利用した基質蛋白質群の機能・性状の解析を行い、各importinが担う輸送の生理的な意義を示した。各importinの基質蛋白質群は複数の細胞内プロセスに関与し、また、それぞれの細胞内プロセスも複数のimportinの基質蛋白質に担われるが、importin-βファミリーの分担する基質蛋白質の機能を介した役割分担が明確となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回同定した同一importinの基質に共通して見られる一次/高次構造を探索し、組換え蛋白質結合実験やin vitro輸送実験により、各importinとの結合部位や核移行シグナルとなる構造の決定を目指す。特にimportin自体の相同性が高いにもかかわらず基質の共通性の低い２つのimportin、例えば importin-13とtransportin-SRについてimportin－基質の特異性を決定する構造を解明し、importin－基質相互作用の進化過程や進化上多くのimportinが派生した理由などを考察する。
12種類のimportinのうち11種類は輸送基質と直接結合するが、importin-βのみは直接または7種類のimportin-αファミリー蛋白質の一つをアダプターとして基質と結合し、より多種類の基質を輸送すると考えられる。今回は、これらを一纏めにしてimportin-βの基質として同定した。今後は、importin-α毎に特異的な基質を同定する。SILAC-Tp法に使用するin vitro核輸送系は、importin-βファミリー輸送因子を除外した核/細胞質抽出液で構成しているが、これに加え、全てのimportin-αを除外する方法を確立し、importin-βと1種類のimportin-αによる核輸送反応を含むSILAC-Tp法を行なう。
細胞分化や環境応答、疾病の過程でimportinの発現量の変化や修飾による機能調節が多く報告されている。報告例の中からいくつかの実験系を選び、本研究でここまでに同定した基質の輸送の調節を検証し、基質の核内機能が細胞に及ぼす作用を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画では、27年度にimportin-βファミリー輸送因子特異的な基質の同定に加えて、アダプターであるimportin-αファミリー蛋白質に特異的な基質の同定を行う予定であったが、実際には、SILAC-Tp法で同定したimportin-βファミリー輸送因子の基質候補蛋白質の蛋白質結合実験による検証を先に進めたため、importin-αファミリー特異的基質の同定を本28年度に行なうこととなっていた。しかしながら、上記importin-βファミリーの基質同定実験では予想を超える膨大なデータが得られたため、28年度は、基質蛋白質の機能・性状に関するデータベース解析と論文発表の準備に多くの時間と労力が必要となり、importin-αファミリー特異的基質の同定実験は29年度に持ち越すこととした。この分の消耗品費、設備備品費、依託費等が29年度使用となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額全額により、27－28年度予定しながら実際には行なわなかったimportin-αファミリー特異的基質の同定を行なう。
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