| 研究課題/領域番号 |
15K07064
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
木村 誠 国立研究開発法人理化学研究所, 今本細胞核機能研究室, 専任研究員 (00290891)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 核輸送 / importin / 蛋白質相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
多くの核蛋白質は核膜上の核膜孔を通過して核－細胞質間を移行するが、その多くは輸送因子による媒介を必要とする。ヒトに20種類存在するimportin-βファミリー蛋白質は、代表的な核－細胞質間輸送（核輸送）因子である。そのうち12種類は細胞質から核内への輸送を担うimportinであり、数千種の蛋白質の輸送を分担すると考えられる。細胞分化や環境変化に応じたimportinの発現調節や機能調節が多く報告され、輸送される基質蛋白質の核局在の変化が細胞の生理的変化を誘導すると考えられる。この核輸送の生理的な機能を解明するためには、個々のimportinに輸送される基質蛋白質を出来るだけ多く知る必要がある。本研究では、研究代表者が確立した基質同定法であるSILAC-Tp法により12種類のimportinの基質蛋白質を大規模同定し、昨年度論文発表した。基質同定の結果、importin-基質相互作用の特異性決定機構に予想を超えた多様性があると示唆され、その確認のため、一次構造の類似性が高いにもかかわらず共通の基質が少ないimportin-13とtransportin-SRについて、アミノ酸置換変異体と多数の基質蛋白質の結合解析を行った。importin-13とtransportin-SRの一方でのみ生物種を超えて保存されたアミノ酸残基には基質結合に関与するものが見られるが、アミノ酸残基ごとの重要度は基質蛋白質により異なることが明らかとなった。この解析データは多様な基質蛋白質へのimportin-βファミリーの進化的対応過程を解明するための基礎的知見となることが期待できる。これと並行して、多数の基質蛋白質の核輸送調節による細胞制御機構の最初の解析系を確立するため、培養細胞でimportinの発現変動が見られる実験系を選定中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初予定したSILAC-Tp法による12種類のヒトimportinの基質同定実験の結果を昨年度論文発表したが、実験には新規導入された質量分析装置を使用したため、得られたデータ量が膨大であったこと、また、同定された基質蛋白質が予想外に多様であったことから、論文執筆に伴う同定結果の生物情報学的解析に予定を大きく超える時間を要した。
多数の基質同定によりimportin-基質蛋白質結合の特異性決定に関わる共通の構造（アミノ酸配列）に関し一定の知見が得られると予想したが、実際には新規の共通構造を見いだすことは出来ず、importin-基質蛋白質結合の様式には予想以上の多様性があることが示唆された。この点について明確にするためには実験的な解析が必要であり、一次構造の類似性が高いにもかかわらず共通の基質が少ないimportin-13とtransportin-SRの変異体を作製して多数の基質との結合解析を行った。結合特異性決定機構の多様性を証明出来たが、当初計画とは異なる進捗となった。
多数の基質蛋白質の核輸送調節による細胞制御機構の解析系の構築は、計画の手順で進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在進行中のimportin-13とtransportin-SRの変異体の基質結合実験を完了し、importin-基質相互作用の進化過程や進化上多くのimportinが派生した理由などを考察する。
12種類のimportinのうち11種類は輸送基質と直接結合するが、importin-βのみは直接または7種類のimportin-αファミリー蛋白質の一つをアダプターとして基質と結合し、より多種類の基質を輸送すると考えられる。今回はこれらを一纏めにしてimportin-βの基質として同定した。今後、importin-α毎に特異的な基質を同定する。SILAC-Tp法に使用するin vitro核輸送系は、importin-βファミリー輸送因子を除外した核/細胞質抽出液で構成しているが、これに加え、全てのimportin-αを除外する方法を確立し、importin-βと1種類のimportin-αによる核輸送反応を含むSILAC-Tp法を行なう。
細胞分化や環境応答、疾病の過程でimportinの発現量の変化や修飾による機能調節が多く報告されている。その多くは培養細胞を用いた実験系を使用しており、報告例の中からいくつかの実験系を選び、本研究でここまでに同定した基質の輸送の調節を検証し、基質の核内機能が細胞に及ぼす作用を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由
当初、27年度にimportin-βファミリー輸送因子特異的な基質とアダプターであるimportin-αファミリー蛋白質に特異的な基質の同定を行う計画であった。しかし実際には、SILAC-Tp法で同定したimportin-βファミリーの基質蛋白質の蛋白質結合実験による検証を先に進め、importin-αファミリー特異的基質の同定は先送りとした。importin-βファミリーの基質同定実験では、予想を超える膨大なデータが得られたため、28年度は、基質蛋白質の機能・性状に関するデータベース解析と論文発表の準備に多くの時間と労力が必要となり、importin-αファミリー特異的基質の同定実験は再度先送りされた。多数の基質の同定によりimportin-β-基質結合の特異性を決定する共通構造が見出されると予想していたが、同定基質の解析の過程で、この特異性の決定機構には予想外の多様性があると考えられたため、29年度に急遽その検証実験を行なった。結果として、当初計画したimportin-αファミリー特異的基質の同定と核-細胞質間輸送の調節による細胞制御機構の解析を期間延長により行うこととなった。この分の消耗品費、依託費等が30年度使用となる。
使用計画
次年度使用額全額により、importin-αファミリー特異的基質の同定、核-細胞質間輸送の調節による細胞制御機構の解析を行なう。
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