研究課題
まず研究実施計画に従い、クロマチン免疫沈降解析（ChIP）によってJmjd3標的遺伝子群の同定を試みた。Mycタグ付きのJmjd3をツメガエル胚に発現させ、抗Myc抗体でJmjd3が結合するクロマチン断片を回収したが、その精製度は、次世代シーケンサーによるChIP-seq解析に十分ではなかった。クロマチンに対するJmjd3の結合が弱いため、ホルムアルデヒドによるクロスリンクを強くして免疫沈降の回収率を上げる必要があったが、それが精製度を下げる原因になったと考えられる。そこで代わりの実験として、Jmjd3を強制発現させた胚からRNAを回収し、感覚器プラコードや神経堤の形成に関わる遺伝子群の発現解析をおこなった。その結果、感覚器プラコード形成遺伝子の中では、noggin、noggin2、dmrta2、foxi2、pitx1等の発現が、神経堤形成遺伝子の中ではpax3、phox2、tead1等の発現がJmjd3によって異所的に活性化することが明らかになった。nogginファミリーはBMP阻害因子をコードし、脊椎動物の胚では神経板形成期にその前部周縁の予定感覚器プラコード領域で発現する。これまでに、ナメクジウオのnogginオーソログは、神経板期に発現しないことが報告されており、それゆえ予定感覚器プラコード領域におけるnogginファミリーの発現は、脊椎動物の祖先種で新たに獲得されたと考えられる。一方、研究代表者は、Jmjd3が脊椎動物の祖先種において、類似した脱メチル化因子から遺伝子重複により派生したことを発見している。これらの知見と上記の実験結果から、感覚器プラコード形成に必要なnogginファミリーの発現は、Jmjd3の引き起こしたコ・オプション（遺伝子転用）の結果である可能性が高いと考えられた。
2: おおむね順調に進展している
クロマチンに対するJmjd3の結合が予想外に弱かったため、当初予定していたChIP-seq解析は中止したが、その代わりにおこなったRNA発現解析により、Jmjd3の下流で活性化する遺伝子群を同定することに成功した。その中に含まれていたnogginファミリーは、感覚器プラコード形成の初期過程で発現することが知られている。また、実績概要で述べたように、感覚器プラコード原基でのnogginファミリーの発現は、脊椎動物の祖先種で起きたコ・オプションにより獲得されたと考えられる。それゆえ本研究の初年度でありながら、その成果は感覚器プラコードの獲得に働いたコ・オプション機構の解明に対して、大きなヒントを与えるものとなった。他にも、Jmjd3の下流遺伝子群として同定したものの中には、神経堤形成遺伝子群も含まれており、予定通りそれらの解析も次年度におこなう予定である。したがって当年度の研究目的は概ね達成したと言える。
当初の研究実施計画に従って進める。次年度は以下の実験をおこなう。（１）Jmjd3の直下で働くコ・オプション遺伝子の同定感覚器プラコード形成遺伝子群に関しては、nogginやnoggin2をJmjd3が直接制御するかどうか、ChIP-qPCR法により調べる。具体的には、Mycタグ付きのJmjd3をツメガエル胚に発現させてから、抗Mycタグ抗体で免疫沈降によりクロマチン断片を回収し、その中にnogginやnoggin2のシス調節領域が濃縮されているかどうかを調べる。また、nogginやnoggin2の発現を、Jmjd3ノックダウン胚において調べ、その発現がJmjd3に依存するかどうか検討する。dmrta2やfoxi2、pitx1については、Jmjd3ノックダウン胚における発現を調べると共に、それらのナメクジウオオーソログが感覚器プラコードの相同組織で発現するかどうか解析し、脊椎動物への進化の過程でコ・オプションを起こした可能性を検討する。神経堤形成遺伝子群に関しては、pax3、phox2、tead1について、dmrta2やfoxi2、pitx1と同様な解析をおこない、それらの発現のJmjd3依存性と、コ・オプションを起こした可能性を検討する。（２）コ・オプション遺伝子ネットワークの解析nogginやnoggin2は、感覚器プラコード形成を制御する遺伝子カスケードの極めて上流に位置する遺伝子である為、特にこれらに注目して解析を進める。具体的には、アンチセンスモルフォリノオリゴあるいはゲノム編集技術によって、nogginやnoggin2の発現を抑制したツメガエル胚を作製し、pax6やfoxe3等の既知のコ・オプション遺伝子群の発現が失われるかどうか調べ、Jmjd3からpax6やfoxe3等に至るコ・オプションカスケードを明らかにする。
研究実績の概要において述べたように、実験結果に従ってChIP-seq解析の代わりにRNA発現解析をおこなったので、その差額分の支出が減少した。
Jmjd3の下流遺伝子群の同定という本年度の目的は、Jmjd3の強制発現胚を用いたRNA発現解析により達成されたが、それら下流遺伝子をJmjd3が直接制御するかどうかについては、ChIP-qPCR実験により検討する必要がある。今回生じた次年度使用額と次年度分として請求した助成金は、このChIP-qPCR実験と、当初から予定していた次年度の実験を遂行するのに用いる。
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