| 研究課題/領域番号 |
15K07084
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| 研究機関 | 同志社大学 |
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研究代表者 |
酒井 大輔 同志社大学, 研究開発推進機構, 助教 (90632646)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 解糖系 / 低酸素 / 神経管閉鎖 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、計画していた質量分析イメージングによるATPや解糖系代謝産物の検出法の確立を目指した。本実験は連携研究者が担当した。連携研究者のグループはマウス胸腺におけるモノヌクレオチドの局在を質量分析イメージングで検出した実績があり、この系を基本として条件検討を行った。胸腺を用いたイメージングではATPの検出が可能であったが、胎生8日目の胚組織では分布を検出する十分な解像度が得られなかった。さらに詳細な条件検討が必要であることがわかった。そこで、ATPのリポーター遺伝子を用いた局在解析を並行して行った。ATPリポーター遺伝子QUEENをを胎生８日目の神経板にエレクトロポレーション法により導入し、蛍光観察を行った。その結果、蛍光は非常に微弱であり、当研究室で所有する顕微鏡では観察が困難であることがわかった。現在、他の研究機関の顕微鏡の使用を検討している。また、代謝産物の内、ラクトースのリポーター遺伝子が市販されているので、QUEENと同様な方法で神経板内での分布の検出を試みる予定である。
解糖系活性化と外環境との関連に関して、低酸素環境に着目して解析を進めた。まず、野生型マウス胚を通常酸素濃度である20%と、低酸素応答が惹起される5%環境下で子宮外培養し、形態形成への影響を調べた。その結果、20%酸素下で神経管の閉鎖不全が認められ、さらに解糖系遺伝子群の発現低下がwhole-mount in situ hybridization、RT-qPCR、ウェスタンブロットなどの解析で確認された。これらの結果は、子宮内の低酸素環境が解糖系の活性化を介して正常な神経管形成を制御していることを示唆している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、質量分析イメージングによる代謝産物の局在解析が、胎生８日目の胚を用いた場合に期待していた解像度を得られないことが判明した。また、ATPリポーター遺伝子を用いた局在解析も、当研究機関で所有する機材では困難であることがわかった。そのため、解析の手段の変更または修正の必要が生じた。しかし一方、解糖系の活性化と外環境との関係に関しては、一定の成果を得ることができた。これらの理由から、本研究課題の進捗状況はやや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
代謝産物の局在解析に関しては、質量分析イメージングの条件検討とともに、蛍光リポーター遺伝子を用いた解析を並行して行う。
解糖系の活性化と外環境との関係に関しては、低酸素応答因子であるHif1alphaに着目し、機能阻害実験や遺伝子欠損動物を用いた解析などにより詳細に解析する。具体的には、siRNAやshRNAを神経板にエレクトロポレーション法により導入し、神経板におけるHif1alphaの機能阻害を行う。Hif1alphaの機能阻害により、神経菅形成のどのステップに異常が生じるのか、分子発生生物学、組織学的な手法を用いて詳細に解析する。これにより、外環境酸素濃度、解糖系、神経管閉鎖の各事象をつなぐ分子機構の解明を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計画していた質量分析イメージングが未だ条件検討の段階であるため、本格的な解析に着手していない。そのため、実験に必要な消耗品や試薬、マウスなどの購入に至らなかった。さらに、参加予定であった発生生物学会が熊本の震災の影響で開催されなかった。これらの理由により、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度は、質量分析イメージングの条件検討と並行して、ラクトースなどの代謝産物に対する蛍光リポーター遺伝子の発現コンストラクトを購入し、蛍光イメージングによる代謝産物の胚体内局在の解析を行う。また、参加できなかった発生生物学会の代わりに、他の学会への参加を検討する。
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