| 研究課題/領域番号 |
15K07094
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| 研究機関 | 埼玉大学 |
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研究代表者 |
山口 雅利 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (20373376)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | NACドメイン転写因子 / シロイヌナズナ / タンパク質相互作用 / ユビキチンE3ライゲース |
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| 研究実績の概要 |
NACドメイン転写因子であるVNI2は、同じくNACドメイン転写因子であるVND7と相互作用する因子として単離された。詳細な解析の結果、VNI2はVND7と結合することで、VND7の転写活性を阻害することが明らかとなっている。このVNI2のさらなる作用機構を解明することを目的として、酵母２ハイブリッド法によるスクリーニングを行った結果、30種ものNACドメイン転写因子が同定された。
今年度はまず、単離した30のNACドメイン転写因子の転写活性能を検証するために、GAL4-BDを融合させた転写因子を、調整したプロトプラスに一過的発現させた。その結果、5つの転写活性化因子と6つの転写抑制因子が存在することが明らかとなった。また、単離されたNACドメイン転写因子とVNI2との二重変異体を多数作出した。その中で、ある相互作用因子単独変異体は塩ストレス耐性を示したのに対して、vni2単独変異体、およびvni2との二重変異体では、そのような耐性形質は観察されなかった。このことから、この相互作用因子はVNI2依存的に塩ストレスに応答することが示唆された。また、vni2変異体、および相互作用因子変異体背景に、それぞれ相互作用因子、VNI2過剰発現用コンストラクトを導入した形質転換体を作出している。
VNI2と相互作用する因子として、NACドメイン転写因子の他に、BTBドメインを有するBMP3が単離された。BTBドメインファミリーはCUL3やRBX1と複合体を形成することで、ユビキチンE3ライゲースとして機能する。BPMはシロイヌナズナ中6遺伝子存在するのに対し、CUL3は2遺伝子のみである。そこで、BPMの機能が低下した植物体として、cul3二重変異体を作出した。これらは、矮性や花成遅延などの表現型を示す。これらcul3二重変異体で表れる表現型がVNI2依存的か検証するため、cul3 vni2三重変異体についても作出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画調書で記載していた、多重変異体や、過剰発現体の作出は全ての組合せではないものの、優先順位の高いものについては概ね完成している。今後は、それら植物体を用いて、解析を行うこととなる。そのための条件検討についても進めており、次年度において作用機構に迫る実験データが得られるものと期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
基本的には上記の通り、これまでに作出した多重変異体や過剰発現体を用いて、機能解析を行っていく。安定した表現型を得るためには、細かい条件設定が重要となることが予想される。なので、30の転写因子全てを並行して行うのではなく、これまでに機能が報告されているものや、強い転写活性化能、もしくは抑制能を持つNACドメイン転写因子を優先的に進めていくなどの工夫が必要であると考えている。
プルダウン解析やBiFC解析などの相互作用解析については、進めているものの現時点ではポジティナが結果が得られていない。組換えタンパク質の調整法や植物細胞内でより高発現させる手法を検討することで、解決したいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度は、海外支援プロジェクトの一環で多くを海外に在籍していた。そのため国内での研究活動の出費は、必要最小限に抑えて研究を行ってきた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度は、消耗品を中心に物品費をとして使用する。また効率的に研究を遂行するために、技術補佐員の人件費に使用する予定である。
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