研究課題/領域番号 |
15K07106
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研究機関 | 奈良女子大学 |
研究代表者 |
奈良 久美 奈良女子大学, 自然科学系, 准教授 (30322663)
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研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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キーワード | 水輸送 / シロイヌナズナ / MRI / アクアポリン / フィトクロムA / 概日時計 / ストレス |
研究実績の概要 |
植物体における水や無機養分の輸送は光や概日時計をはじめとした様々な外的・内的な因子によって調節されている。さらに、乾燥や無機養分の枯渇などのストレスにも影響される。本研究の目的は、光や時計によるアクアポリンや根の水透過性の調節を軸として、植物体における物質輸送、及び植物の成長やストレスへの応答の仕組みを調べることである。 これまでの私達の研究で、時計変異体であるelf3変異体の根においてリン酸化されたPIP2sが多いことが示されていたが、他の器官においては調べられていなかった。また、elf3変異体における根の水透過性も調べられていなかった。そこでまず、複数の器官においてリン酸化されたPIP2の量を調べるとともに、elf3変異体と野生型の根の水透過性に違いがあるかを調べた。その結果、根の水透過性とリン酸化されたPIP2sの割合について、どちらも変異体で高いことがわかった。 次に、シロイヌナズナのMRI実験を行うための実施体制を確立し、植物の栽培法およびMRIによる流速測定法(位相シフト法、流れ検出グラジエント法など)を検討した。今後は、MRIによる野生型とelf3変異体の流速測定を実現させ、PIP2sのリン酸化と根の水透過性の違いが、シロイヌナズナの水の輸送に与える影響について調べていきたい。 一方で、液胞膜アクアポリンTIP2;2とTIP2;3の成長やストレスに対する役割を調べるために、tip2;2変異体及び、tip2;3変異体の表現型を調べる実験も実施した。その結果、この2つのアクアポリンが成長やストレス応答に対してそれぞれ異なる役割を持っていることがわかった。光受容体の変異体を用いたMRIデータの再解析や統計、TIP2;2の量や局在を調べるための材料の作製も行っており、今後、これらの材料を生かし、TIP2sの役割についても詳細に解析していきたい。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H27年度には、1)MRI実験の実施体制の確立と計測条件の検討等、2)シロイヌナズナの根の水透過性とアクアポリンPIP2sのリン酸化の解析、3)シロイヌナズナの液胞膜アクアポリン遺伝子のノックアウト系統の成長解析等を行った。 1)に関しては、シロイヌナズナのMRI実験の実施体制、植物の栽培法等についてはほぼ確立できた。さらに、フローファントムの作製と3Dスピンエコー法、位相シフト法、流れ検出グラジエント法などによる流速の計測を試した。何れの計測法も、今後、小さな個体サイズに対応させる必要がある。 2)に関しては、シロイヌナズナ野生型とelf3変異体の根の水透過性について調べた結果、両者に明瞭な違いがあることが示された。また、リン酸化されたPIP2sの量についても、これら2つの系統の複数の器官において異なっていることを示す結果が得られた。これらの実験に関しては概ね計画通りに進行している。ただし、根の水透過性の概日の変化については、個体差が大きかったため、プレッシャーチャンバー法による測定では統計的に有意な差を示すことは難しかった。 3)に関しては、計画通りに実験が進行している。まず、シロイヌナズナの液胞膜アクアポリンTIP2;2、TIP2;3遺伝子のノックアウト系統(tip2;2変異体 及び、tip2;3変異体)の胚軸と根の長さを野生型と比較する実験を行った。現在までのところ、無機塩類を含む培地や窒素を含まない培地で栽培した場合に、系統間で統計的に有意な成長の違いが観察されている。また、塩ストレス条件下での成長の比較も行っている。さらに、tip2;2変異体とtip2;3変異体を交配し、tip2;2 tip2;3二重変異体の作製を進めており、現在、候補系統を選抜し、2度目の戻し交雑を行っている段階である。
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今後の研究の推進方策 |
H27年度に実施したMRI実験の条件検討に関しては、研究代表者と奈良女子大の研究協力者、筑波大の連携研究者及び研究協力者が協力して実施した。奈良女子大において栽培した植物を筑波大に送付し、流速測定に関する予備実験を行った。H28年度以降は必要に応じて、植物の栽培条件を厳密に管理しながらMRI実験をするために、植物栽培のための研究協力者(筑波大)の雇用、研究協力者(奈良女子大)の筑波大への派遣を予定している。 一方で、シロイヌナズナの根の水透過性とアクアポリンPIP2sのリン酸化の解析、液胞膜アクアポリンのノックアウト系統の成長及びストレス応答への解析を精力的に進めたため、試薬等の消耗品費の使用が予定額を上回った。さらに、研究に必須の備品(ディープフリーザー、及び高圧蒸気滅菌器)がH27年度中に故障したため、ディープフリーザーをH27年度中に修理し、高圧蒸気滅菌器をH28年度に購入するよう計画を変更した。この計画変更に伴い、H27年度中に作製予定であったペプチド及び抗体作製を見合わせ、市販の抗体の利用を試みることとした。 H28年度以降は、MRIによるシロイヌナズナの流速測定を実現するための手法の開発やプローブの作製等を引き続き実施する。さらに野生型とelf3変異体のMRIによる流速測定を試みるとともに、光合成蒸散測定装置を用いた蒸散速度の比較も実施する予定である。液胞膜アクアポリンTIP2;2、TIP2;3の成長やストレス応答への役割に関しては、ストレス条件下でのノックアウト系統の成長の比較に加えて、リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析にも着手する。tip2;2 tip2;3二重変異体の作製についてもH28年度中に終え、表現型の解析に着手する。フィトクロムAによるアクアポリン発現と水輸送の調節についても総合的な研究を続ける。以上のように、多方面から研究を推進する。
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次年度使用額が生じた理由 |
H27年度は、奈良女子大において栽培した植物を筑波大に送付し、流速測定に関する予備実験を行った。予備実験であるため、植物の栽培条件の厳密な管理が必要なかったので、植物栽培のための研究協力者(筑波大)の雇用、研究協力者(奈良女子大)の筑波大への派遣を行わなかった。そのため、計画していた人件費と旅費を使用しなかった。一方で、奈良女子大においてシロイヌナズナの変異体や遺伝子組換え植物を用いた研究を精力的に進めていたH27年度の秋~冬にかけて、研究に必須の備品(ディープフリーザー、及び高圧蒸気滅菌器)があいついで故障した。そのため、ディープフリーザーをH27年度中に修理し、高圧蒸気滅菌器については、H28年度の予算とH27年度の未使用額を合わせて購入できるよう研究計画を変更した。以上の理由で次年度使用額が発生した。
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次年度使用額の使用計画 |
H27年度に生じた次年度使用額とH28年度分の助成金とを合わせ、研究に必須の備品である高圧蒸気滅菌器の購入に用いる。高圧蒸気滅菌器は、植物の無菌栽培、及び遺伝子組換え体の廃棄のために常に使用する備品であり、本研究を遂行するために必要である。
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