| 研究課題/領域番号 |
15K07116
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| 研究機関 | 中部大学 |
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研究代表者 |
町田 千代子 中部大学, 応用生物学部, 教授 (70314060)
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| 研究分担者 |
高橋 広夫 千葉大学, 大学院園芸学研究科, 准教授 (30454367)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 葉の発生分化 / gene body メチル化 / DNAメチル化 / 核小体 / エピジェネティクス / シロイヌナズナ |
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| 研究実績の概要 |
植物細胞は、分化状態から容易に未分化状態（幹細胞的性質）になりうることが古くから知られている。細胞分化過程では、植物に特徴的なエピジェネティックな機構があると考えられるが、その分子メカニズムは、未だ明らかになっていない。葉は茎頂メリステムから分化する地上部の主要な器官であり、葉の初期分化過程は、器官分化の優れたモデルとなっている。特に、葉の向背軸（表裏）の極性の確立は扁平な形態的特徴をもつ葉の形成過程の鍵と成っている。我々は向背軸の極性確立において、シロイヌナズナAS1-AS2がARF3に直接結合して転写制御すること、ARF3のgene body DNAメチル化のレベルの維持に関わることを明らかにした。本研究の目的は、AS1-AS2によるARF3の抑制機構をモデルとして、植物発生に特徴的なエピジェネティック制御機構を明らかにする事である。2016年度は、(1) ARF3遺伝子のExon 6, 9, 10のDNAメチル化レベルとARF3の発現レベル、葉の表現型に相関がある事、メチル化レベルの維持には、AS1, AS2に加えて、NUC1, FAS1, TOP1αが関わる事がわかった（論文投稿準備中）。(2) as1変異体、as2変異体においては、いずれも、メチル化レベルが減少するものの、減少するCG配列のポジションが異なる事がわかった。AS1とAS2のMET1によるCGのメチル化への関わり方が異なる事を示唆している（論文投稿準備中）。(3) AS2タンパク質のAS2ドメイン内のC-motifが核小体周縁部のAS2-body形成とAS2の機能に必要であることがわかった。これらの結果から、AS1-AS2は、核小体周縁部において、ARF3遺伝子のメチル化に関わり、ARF3遺伝子を発現抑制する事が、葉の向背軸の極性の確立と扁平な葉の形成に重要である事が示唆される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1)葉の表側分化の強い欠損（棒状葉）を示す変異体におけるARF3遺伝子座のDNAメチル化パターンの解析：as1、as2変異体にDNA複製の阻害剤を投与した場合に、表側分化不全による棒状の葉を形成した。一方、微小官の脱重合の阻害剤は、棒状葉を形成する事はなかった。この事は、AS1-AS2が関わる葉の向背軸分化には、DNA複製が正常に進行する事が必要である事を示唆している。そこでまず、葉の表側分化の強い欠損を示すCAF1の構成因子であるFAS1の変異体におけるARF3遺伝子座のDNAのメチル化パターンの解析を行った所、top1α、nuc1変異体と共通なポジションのCGメチル化に変化が認められ、CGメチル化と表現型との関わりが示唆された。
(2)葉の表裏細胞の分化に伴うARF3のgene body DNAメチル化の役割の解析：exon6には、CG配列が6カ所あり、野生型では100%メチル化されていた。as1とas2変異体においては、いずれも、メチル化レベルが減少するものの、減少するCG配列のポジションが異なる事がわかった。この事は、AS1とAS2のMET1によるCGのメチル化への関わり方が異なる事を示唆している。
(3)AS2タンパク質のAS2ドメインの機能解析：AS1はMybドメインを持つ転写抑制因子、AS2は植物に特異的なcystein rich repeat配列（C―motif）を含むAS2ドメインをもつタンパク質であり、複合体を形成して機能する。我々は既に、AS2が核小体の周縁部にスペックルを形成（AS2-bodyと命名）、AS1はAS2-bodyに共局在することを報告した。AS2ドメインのC-motifを欠損させるとAS2-bodyが形成されずas2変異体の表現型を相補しなかった。AS2の機能におけるC-motif の重要性が明らかになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)ARF3遺伝子座のDNAメチル化パターンの解析
葉の表側分化の強い欠損を示す変異体であるヌクレオリン、核小体局在タンパク質RNAヘリカーゼ（RH10）I型トポイソメラーゼの遺伝子の変異体におけるARF3遺伝子座のDNAメチル化パターンを解析する。また、ARF4遺伝子座のDNAメチル化パターンについても解析し、葉の表現型とARF3とARF4遺伝子座全体のDNAメチル化との関連を明らかにする。
(2)AS1-AS2と相互作用する因子の探索と同定
AS1-AS2と相互作用する因子を探索するための形質転換体を用いて、プロテオーム解析を行う。また、met1 as1二重変異体、met1 as2二重変異体を作成したので、遺伝的相互作用について解析する。
(3)AS2タンパク質のAS2ドメインの機能解析：AS2ドメインに特徴的なC-motif、Conserved-Gをふくむ Internal region, Leucine-zipper-like domainの領域について細胞内局在とAS2の機能との関連を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画で記述したDNAメチル化解析の予定が遅れたため、消耗品を繰越すことになった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
新たなDNAメチル化解析に使用する予定である。また、それらの実験を補助する、研究補助員の雇用にもあてる予定である。
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