| 研究課題/領域番号 |
15K07121
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
小林 一也 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (50360110)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | プラナリア / 生殖様式転換 / 生殖細胞 / 有性化因子 |
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| 研究実績の概要 |
プラナリアの生殖様式転換機構解明の手がかりであり、多能性幹細胞から生殖細胞を誘導する側面もあわせもつ有性化因子を同定することを目的とする。有性化因子は有性個体の卵黄腺というプラナリア特有の生殖器官に含まれており、私達は有性化活性を示すM0M10Fr.と呼ぶ粗精製法を確立している。M0M10Fr.にはTrpやその代謝物5-HTPが含まれ部分的な有性化活性（卵巣誘導）を持つこと、また、M0M10Fr.中の複数の化合物の相加・相乗効果によって完全な有性化が引き起こされることが示唆されている。本研究では、①有性化因子の単離・同定、②卵黄腺で産生されるTrp代謝物の解析を行っている。
研究項目①では、メタボローム解析により無性個体と比較して有性個体あるいは卵黄腺に多く含まれる化合物群の中で、M0M10Fr.にも含まれている化合物をLC/MS解析により探索した。その結果、4-pyridoxic acid、3’,4’-cyclic dAMP、Ascorbic acidの3化合物が同定された。各物質単独での生物検定ではTrpや5-HTP同様に部分的な有性化活性が認められた。しかし、これらの化合物の混合物でも無性個体を完全に有性化することはできなかった。研究項目②では、未知の有性化因子には卵黄腺由来のTrpや5HTPの代謝物があると考えているので、卵黄腺で発現している芳香族アミノ酸の代謝に関わる酵素に注目した。無性個体と有性個体間のトランスクリプトーム解析を行ったところ、DEG数は8680、その内、有性個体高発現遺伝子は7417 得られた。有性個体高発現遺伝子に関して、そのアノテーション情報をもとにして有為に高発現している代謝7経路にTrp代謝が含まれていた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究項目①では、M0M10Fr.をさらに分画／精製して新たな有性化因子を同定するために、出発材料のM0M10Fr.を大量に調整する必要がある。確立したM0M10Fr.調整法では、有性化因子のソースであるオオミスジコウガイビルBipalium nobileやイズミオオウズムシBdellocephala brunneaはまずPBS中でホモジナイズするが、大量に調整したM0M10Fr.をさらに分画した場合、PBSから混入する大量の塩のために給餌による生物検定の際に検定個体の調子が悪くなるという問題が発生したため、研究の進行が遅れている。
有性化因子を含んでいる卵黄腺にはTrpや5-HTPが大量に含まれている。研究項目②では、未知の有性化因子にはTrpや5HTPの代謝物があると考えているので、卵黄腺で発現している芳香族アミノ酸の代謝に関わる酵素に注目している。Trpから5-HTPを合成する酵素TPHは卵黄腺では発現していないので、卵黄腺にはTPH活性を持つ別の酵素が存在していなければならない。PAH（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）にはTPH活性があるという報告が哺乳類である（Renson et al., 1962, JBC）ことから、卵黄腺で発現しているPAHホモログ、Dr-PAHをクローニングしてレコンビナントを作製し、TPH活性を持っているのかを検証することを目指している。本研究中にRNA-seqデータからリュウキュウナミウズムシDugesia ryukyuesisの発現遺伝子カタログが構築されたことで、PAHホモログが2種存在していることがわかった。レコンビナント作製の前に、卵黄腺で高発現しているPAHホモログがどちらであるか、あるいは双方であるかを検証する必要があったので、研究の進行が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究項目①では、M0M10Fr.中の塩がその後の生物検定で問題になるので、PBSを用いない抽出方法を確立して、有性化因子の単離／精製を進める。
研究項目②では、2種存在しているPAHホモログの内、卵黄腺で特異的に発現しているPAHホモログを発現解析により特定できている。卵黄腺特異的PAHホモログをDr-PAH-1、そして、卵黄腺以外（おそらく脳／神経系）で発現しているPAHホモログをDr-PAH-2とした。今後、Dr-PAH-1のレコンビナントを作製してTPH活性の有無を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していたレコンビナントタンパクの作製を行えなかったため。また、予定していた研究動物の採集が採集地の環境が変わり動物が激減したために見送ったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度、レコンビナントタンパクの作製の為の消耗品等を購入する。また、新たに研究動物の採集地を確保するために旅費を使用する。
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