| 研究課題/領域番号 |
15K07151
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
鈴木 知彦 高知大学, 教育研究部自然科学系理学部門, 教授 (60145109)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ゾウリムシ / 繊毛運動 / アルギニンキナーゼ / 酵素の局在 |
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| 研究実績の概要 |
高度な生理機能の維持には，酵素の局在化が重要な役割を果たしている場合が多い．この局在化が妨げられると酵素は本来の行き場を失い生理機能に重大な支障をきたす． 我々は，繊毛虫Tetrahymenaのアルギニンキナーゼ（AK1）が，N末端のミリストイル基を介して繊毛膜に局在していることを明らかにした．そして，繊毛運動においてAK1をキー酵素とする連続的なATP供給機構を提唱した．一方で，繊毛虫Parameciumでは事情が大きく異なる．後者のAKは，N末のミリストイル化シグナル配列を欠く．しかし代わりに，C末端に疎水性のプレニル基を結合させるシグナル配列を持っていた．つまり，両者は全く異なる方法でAK酵素を繊毛膜に局在させている可能性が高いのである．
これまでの研究ではP. tetraureliaに含まれる４種類のAK酵素の性質と発現量を調べ，それらの局在を予備的に調べた．また，一つのAK酵素が基質アルギニンによる阻害（基質阻害）を受けることを明らかにした．今年は，以下の進捗状況の欄に詳細が記載されているように，P. tetraurelia の４種類のAKの細胞内局在を明確にするとともに，摂餌法によるAK1，AK2及び AK3遺伝子の発現阻害実験を行った．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヨツヒメゾウリムシAKの細胞内局在をウエスタンブロットにより調べた．細胞全体，繊毛，及び脱毛した細胞のそれぞれからタンパク質を抽出し，AK2とAK3のポリクローナル抗体を使ってAKの局在を調べた．この結果，AK2は細胞全体と脱毛細胞において強く検出され，繊毛画分では弱く検出された．一方，AK3抗体ではシグナルは検出されなかった． AK3はプレニル基によって膜に結合している可能性が高く，結果的に，可溶化しにくいと考えられたので， 再度，1% TritonX-100で処理したタンパク質を使ってウエスタンブロットを行った．この結果， AK3抗体でも繊毛画分でAKが検出された．
ヨツヒメゾウリムシにおいては，摂餌法による遺伝子の発現阻害が容易に行うことができる．そこでAK1，AK2及び AK3の発現を阻害し，AKの生理学的意義を調べた．三種類のAKの発現阻害をPCRにより確認し，それぞれの遊泳速度を測定した．その結果，プレニル化シグナル配列を持ち繊毛に局在している可能性があるAK1とAK3の発現阻害では，コントロールの遊泳速度(0.502 mm/s)よりも有意な遊泳速度の低下(AK1: 0.268，AK3: 0.298) が見られた．一方で，AK2の発現を阻害しても，有意な遊泳速度の差は見られなかった．このことは，ヨツヒメゾウリムシにおける「アルギニンリン酸シャトル機構」の存在を支持している．次に，遊泳速度が低下したAK1とAK3の発現をダブルノックダウンし，遊泳速度の観察を行った．予想と異なり，遊泳速度(0.334)は，この一連の実験でのコントロールの遊泳速度(0.185)よりも有意に上昇した．しかし，この時の遊泳行動は通常時とは異なり，大きな螺旋運動に変化した．
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は，AK3酵素の基質阻害メカニズムの詳細やその生理的意義に関する研究を予定している．また，総まとめとして研究論文発表を行う．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）本年度行う予定であったペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）の再分析の実施を中止し，より生理機能が明らかになる可能性のあるRNAiによる機能阻害実験等に変更したため．
（使用計画）研究の最終段階における確認実験（ウエスタンブロットによるAKの局在，RNAi阻害実験，AK3の基質阻害メカニズムの詳細メカニズム，原生生物AK酵素類のクローニングと酵素の性質）のための消耗品等の支払い等に予算を適切に使用する予定である．
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