研究課題
本年度は研究計画に掲げた通り、Rif1(Rap1-interacting protein)をノックダウンしたマウス胚性幹細胞(ES細胞)で遺伝子発現の再解析をリアルタイムPCRにより行った。マイクロアレイの結果の通り、Rif1ノックダウンにより2細胞期遺伝子であるZscan4, Ups17l, AA684185の発現が30から70倍に脱抑制された。これらは複数のファミリー遺伝子からなる遺伝子クラスターを形成しており、配列特異的プライマーでの解析によりクラスター全体の転写が活性化していると推測された。また内在性レトロウィルスの発現を調べたところ、LINE、SINE、ERV1、IAPはほぼ不変だが LTR型クラスIIIに属するMERV-Lの発現のみ著しく上昇していることがわかった。これらの遺伝子群の発現がRif1のノックダウンによりどのように脱抑制されているか明らかにするため、クロマチン構造解析を行い以下の結果を得た。 1) DNAメチル化解析:バイサルファイトシーケンス法によりZscan4の遺伝子の近傍、特に上流4.5 kbのエンハンサー領域でメチル化が低下していることを見出した。MERV-L遺伝子領域でも低下していたがIAPではあまり影響がなかった。 2) 染色体構造解析:マイクロコッカスヌクレアーゼ処理したゲノムDNAでサザンブロット解析を行ったところ、Zscan4遺伝子やメジャーサテライトなど特定のゲノム領域でヌクレアーゼへの感受性が増加した。以上のことからRif1の発現が低下したES細胞では、2細胞期遺伝子などの遺伝子領域において局所的にクロマチン構造の変化やDNA脱メチル化が見られ、脱抑制による著しい転写の活性化が起こっていることがわかった。
2: おおむね順調に進展している
マウスES細胞におけるRif1のノックダウンにより、2細胞期遺伝子だけでなく内在性レトルウィルス因子MERV-Lの脱抑制が誘導されており、確かにES細胞の2細胞期胚様状態(super state)が出現していることが認められた。また、遺伝子発現制御のメカニズム解明を目的としてエピゲノム解析を行い、Rif1がZscan4の遠位の上流領域(エンハンサー領域と推定される)において、予想以上にDNAメチルに寄与していることを見出した。計画ではクロマチン免疫沈降も行う予定であったが、重複遺伝子領域の塩基配列の複雑から本年度は増幅用プライマーの設計をするにとどまった。一方で、計画になかった、クロマチン構造解析(ヌクレアーゼ消化したゲノムDNAのサザンブロット解析)を複数のゲノム領域について実施し、Rif1のノックダウンはグローバルな染色体構造には影響を与えないこと、その反面、制御標的領域では染色体がオープンな構造に変化していることがわかった。Rif1と協調的に機能する因子については、質量分析の結果に基づきいていくつかの候補を想定しており、本年度は予備的な免疫沈降実験によりRif1との相互作用を確認できた。全体として概ね計画通り研究が進んでいる。
1.Rif1によるクロマチン構造制御のメカニズムの解明 1) DNAメチル化:Dmnt1及びTet1/2の影響をRNAi、阻害剤などを組み合わせて調べる。 2) プロモーター解析:2細胞期遺伝子上流配列へのRif1の結合を調べる。また、Rif1の標的遺伝子の転写因子の候補(Tbx3など)について、共抑制などにより遺伝子発現に影響するか調べる。 3) ヒストン修飾:2細胞期遺伝子領域のヒストン修飾(H3K4me, K9me, K27me, K79me2)とノックダウンによる影響を調べる。Rif1結合因子のうち、これに関与するヒストン修飾酵素を同定する。 4) Rif1の染色体結合部位の同定: Rif1 クロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP-seq)データの再解析を行う。細胞分化の重要なマスターレギュレーター遺伝子の上流にRif1が蓄積しているとの予備的な結果を得ており、重点的に調べる。5) 免疫沈降による染色体相互作用部位(ChIA-PET)解析 以上の結果をまとめて論文出版を目指す。2.Rif1ノックダウンによるクラスター遺伝子の転写誘導法の開発、および幹細胞のsuper state誘導による多能性向上法の開発:Rif1の発現抑制がクラスター遺伝子を標的としていることを利用して、この領域に別の遺伝子を挿入、または2細胞期遺伝子の制御領域を異所的に導入した細胞を作製して、特定の遺伝子の発現制御を行う方法を開発する。また、ES細胞の2細胞期胚状態を誘導できることから、iPS細胞または特定の細胞系譜の幹細胞へのリプログラミングの過程でRif1の発現を制御し、多能性獲得の効率を改善する。
物品購入を計画していたが本年度中に納品されないことが判明したため。
免疫沈降用抗体の購入
すべて 2016 2015
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (2件) 図書 (1件)
J. Biol. Chem.
巻: 291 ページ: 6316,6330
doi: 10.1074/jbc.M116.713842