| 研究課題/領域番号 |
15K07365
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| 研究機関 | 秋田県立大学 |
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研究代表者 |
春日 和 秋田県立大学, 生物資源科学部, 准教授 (40315594)
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| 研究分担者 |
牟田口 祐太 秋田県立大学, 生物資源科学部, 助教 (30724314)
志村 洋一郎 秋田県立大学, 生物資源科学部, 助教 (60332920)
小嶋 郁夫 秋田県立大学, 生物資源科学部, 教授 (90315581)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | リグノセルロース / 抗生物質生産 / 放線菌 |
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| 研究実績の概要 |
我々は、LC(リグノセルロース)を原材料として抗生物質発酵生産が可能な放線菌を育種する技術開発を目指している。研究開始までにLCを炭素源として750株の放線菌株を培養し、カルボキシメチルセルロース(CMC)分解アッセイにより分泌されたセルラーゼを評価し、LCを高度に資化するStreptomyces属放線菌4株を選抜していた。しかし、このうち2株はCMC分解活性に比べ結晶性ろ紙セルロースの分解活性が低く、研究素材として不適切だった。また、残り2株は抗生物質生産プラスミドの導入により実際に抗生物質生産を生産させることができなかった。そこで改めて保有株から、高セルラーゼ活性を分泌し、抗生物質生産プラスミドの導入により物質生産が可能な放線菌株を選抜した。
保有する1,500菌株に対してCMC分解アッセイを行い、活性が強い27株を再選抜した。これらについて、LC培養時の上清に分泌されたろ紙セルロース分解活性を測定し、既存のセルロース資化放線菌S. thermocarboxydus C42の値(1.6 mU/mL)よりも高い、2.0 mU/mL以上の値を示した13株を選抜した。このうち９株は16S rDNA遺伝子配列よりStreptomyces属であることが明らかになった。さらに9株のうち6株はプロトプラストの形質転換が可能だった。さらに、抗生物質カスガマイシン(KSM)生産プラスミドpKSM109を導入してバイオアッセイによりKSM生産能を調べたところ、２株(Y810およびY1826)の形質転換株が陽性を示した。KSM生産用栄養培地で発酵試験を行ったところ、Y810形質転換株は720 μg/mL 、Y1826形質転換株は950 μg/mLのKSMを生産できた。以上より、LCを資化してセルロース分解活性を高分泌し、抗生物質生産能を付与可能な放線菌2株を取得することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
当初選定した菌株の能力が研究目的に合致していないと判断されたため、改めて菌株の選抜を行う必要が生じた。そのため、H27年度に行う予定だったLC資化放線菌の分解能評価、LCを発酵原料とした抗生物質生産試験が完了しておらず、ゲノム解読を開始することができなかった。今年度は、学生の研究テーマにすることができたため、遅れを少しでも取り戻せるようにする。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、実際にLCを発酵原料とした抗生物質生産試験やLC分解活性試験を行ってLC有効活用に優位な菌株を確定し、その菌株のゲノム解読を進める予定である。
(1) H27年度に新規に選んだ15菌株のうち5株は、今年度前半期中に、遺伝子導入系の確立からKSM生産プラスミド導入による生産試験まで完了する。さらに実際に各種LCを発酵原料としたKSM生産試験を行い、物質生産宿主としての能力を検討する。
(2) 同時に15菌株について、キシランやリグニンなど、セルロース以外のLCの分解活性を検討し、(1)と合わせて総合的に、物質生産宿主として最も適した株を選定する。
(3) (2)により選ばれた株のゲノム解読を開始する。現時点では、効率的かつ効果的に研究をすすめるために、外注（PacBio RS II）を検討している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初選定した菌株の能力が研究目的に合致していないと判断されたため、改めて菌株の選抜を行う必要が生じた。そのため、H27年度予定だったLC資化放線菌のゲノム解読を開始することができなかった。そのため、この分の予算をH28年度に実施予定のゲノム解読用にとっておく必要があった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
効率よく効果的に研究をすすめるため、ゲノム解読は外注する予定である。ゲノム解読にはさまざまなメーカーのシークエンサーが開発されているが、その中でも比較的長い配列を決定することが可能で、ゲノム中に分布する繰り返し配列によるギャップ生成を最小化できるシステムをもつ外注先を利用する。これにより研究の遅れも軽減することが可能と考えている。そのための予算を概算して計上している。
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