| 研究課題/領域番号 |
15K07381
|
|---|
| 研究機関 | 東北大学 |
|---|
研究代表者 |
門倉 広 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (70224558)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| キーワード | ジスルフィド結合 / 哺乳動物 / 膵臓 / 小胞体 / PDI |
|---|
| 研究実績の概要 |
ジスルフィド結合の形成は、分泌タンパク質にとって立体構造形成上、重要な反応ステップである。哺乳動物の小胞体内にはジスルフィド結合の形成に関わると予想されるPDIファミリー酵素が20種類以上知られている。その内、分泌タンパク質を大量に生産する膵臓で強く発現するPDIファミリー酵素であるP5、ERp46等の機能を解明するために、これらの酵素の基質の同定を進めた。このためには、チオレドキシン様の酵素が、ジスルフィド結合の形成、還元、 異性化をおこなう際には、酵素と基質がジスルフィド結合で連結した中間体が形成することを利用した。研究の過程でP5やERp46と同じくPDIファミリーに属する酵素であるPDIp（機能は不明）の臓器分布を調べた所、膵臓で強くかつ特異的に発現していた。そこで、本酵素も研究の対象に加えた。これらの酵素の基質を同定するためには上述の酵素・基質複合体を安定化させた後、酵素に対する抗体を利用して複合体を精製する必要がある。幸運なことに作成したPDIp抗体は免疫沈降に優れていたため、NEM処理をした膵臓試料からPDIpと基質の複合体を精製することに成功した。更に、質量分析により、PDIpと複合体を形成しているタンパク質を網羅的に同定することに成功した。その結果、本タンパク質の機能に関して有用な情報を得た。
低酸素条件下にジスルフィド結合形成に働くシステムを理解するために低酸素条件下誘導される血管内皮細胞増殖因子(VEGF)へのジスルフィド結合の導入に働く酵素を同定する。そのためにはVEGFと酵素の間に形成される複合体を安定化して精製する必要がある。検討の結果VEGF抗体は免疫沈降に適さなかった。そこでVEGFにFLAGタグを導入した。HeLa細胞で同タンパク質を発現した所、VEGF（２量体で存在）の２量体と予想されるバンドの他、VEGFを含む多数のバンドを検出した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、主に、２つのアプローチによって研究を進めている。第１のアプローチでは膵臓で高発現しているPDIファミリータンパク質の生理的な基質を同定することによって分泌タンパク質を大量に生産する膵臓におけるジスルフィド形成システムを理解することを目的にしている。平成27年度は、膵臓で特異的に発現しているPDIpと基質の間で形成された共有結合中間体と予想される複合体を、膵臓から精製するとともに、その中に含まれるタンパク質をマススペクトル解析によって網羅的に同定することに成功した。まだ、この段階では同定したタンパク質は、基質の候補タンパク質に過ぎないが、PDIpの生理基質の同定に向けて大きな前進である。第２のアプローチでは、低酸素条件下ジスルフィド結合形成に働くシステムを理解するためにVEGFと共有結合中間体を形成する酵素の同定を試みた。実験を進めてみると、VEGF抗体は免疫沈降には適さないことがわかった。その過程で様々な条件下免疫沈降実験をおこなう必要があったため、実験が遅れている。免疫沈降における問題を解決するためにVEGFにFLAGタグを連結した。その結果VEGF関連タンパク質を複数検出することに成功した。FLAGタグに対しては免疫沈降に優れた抗体があるので、今後、免疫沈降を利用した複合体の精製などの実験を行えるはずである。
|
| 今後の研究の推進方策 |
1. 膵臓で特異的に高発現しているPDIファミリータンパク質であるPDIpの機能の解析
膵臓の内分泌細胞はインスリンなどのホルモンを血中に生産し、外分泌細胞は大量の消化酵素を消化管中に放出する。PDIpの膵臓内における分布を調べた所PDIpは外分泌細胞で特異的に発現していることが判明した。そこで、今年度はPDIpの機能を解析するために、外分泌細胞由来の培養細胞株であるAR42Jを利用する。既にAR42J株は入手済みであり、今後、本細胞株中でPDIpのノックダウンや過剰発現が同定された基質候補タンパク質の生合成に及ぼす影響を調べることによって、PDIpの生理的な機能を解明する。
２．P5もしくはERp46の生理的な基質の同定
初年度における解析からこれらの酵素に対する抗体は免疫沈降を行う上で、問題があった。今後、免疫沈降に適した抗体を探し、平成27年度にPDIpに対して用いたものと同様の方法を用いてこれらの酵素の基質候補タンパク質を同定する。
３．VEGFと複合体を形成する因子の同定およびその機能の解析
引き続き、低酸素条件下にジスルフィド結合形成に働くシステムを解明するために、低酸素条件下誘導合成される血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のジスルフィド結合形成に関わる酵素を同定する。このためにはVEGFに連結させたFLAGタグを利用する。目的の因子が得られたら、当該因子がVEGFの生合成に果たす役割を解明するために、当該因子の発現をsiRNA等で抑制させた場合の影響をパルスチェイス実験等で解析する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
先述したように、上述のアプローチ2では、予想外の実験条件の検討が必要になりました。このため、当初予定していた実験が行えなかったため、平成28年度への繰越金が生じました。しかし、先述したように、FLAGタグの利用により問題点は解決したので、平成28年度には、平成27年度に行えなかった実験と当初平成28年度に予定していた実験の両方を進める予定です。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
これらの実験には消耗品としては、汎用の薬品や器具の他、様々な基質候補タンパク質のcDNAをクローン化し発現させるために必要となる、化学合成オリゴヌクレオチドが必要になります。更に、消耗品費は、タンパク質の検出に必要な抗体や、遺伝子を動物細胞にトランスフェクションするための試薬、動物細胞の培養や維持に必要な試薬や器具の購入にも、使用します。また、パルスチェイス実験に必要な、放射性アミノ酸も購入します。更に、研究成果を学会等で積極的に発表し、その場での議論を研究の発展に生かしたく、研究費は国内旅費、外国旅費としても利用したいと考えております。その他、論文発表のための費用を計上しています。
|
