| 研究課題/領域番号 |
15K07381
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
門倉 広 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (70224558)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ジスルフィド結合 / 哺乳動物 / 膵臓 / 小胞体 / PDI |
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| 研究実績の概要 |
平成27年度および平成28年度における解析から、PDIファミリー酵素のひとつであるPDIpは、1)膵臓の外分泌細胞で強く発現しており、2) 膵臓中でエラスターゼ、キモトリプシン、α-アミラーゼなどの消化酵素と分子間ジスルフィド結合を介して直接相互作用すること、3) 更に、エラスターゼ前駆体の凝集体形成を抑制する働きを持つことを明らかにした。
これらの結果をもとに本年度は次の解析を行なった。エラスターゼは不活性型の前駆体（プロエラスターゼ）として分泌された後、消化管内でトリプシンによる部分切断を受けて活性化する。平成28年度までの解析からPDIpの共発現にともない、プロエラスターゼは、凝集体形成を免れることが判明していた。この際、PDIp存在下蓄積したプロエラスターゼは、プロエラスターゼが持つべき正しい立体構造を形成しているであろうか？本年度はこのことを調べるために、HeLa細胞中で発現させたプロエラスターゼをFLAGタグを利用して精製し、少量のトリプシンで処理した後、合成基質を利用してエラスターゼ活性を測定した。その結果、PDIp存在下、HeLa細胞で発現させたプロエラスターゼはトリプシン処理により顕著なエラスターゼ活性を発現した。このようなエラスターゼ活性の発現にはPDIpの共発現が必要であった。以上の結果から、PDIpはエラスターゼの前駆体（プロエラスターゼ）と分子間のジスルフィド結合を介して相互作用し、その凝集体形成を抑制するとともに、プロエラスターゼの正しい折りたたみを促進しうることが判明した。
以上のほか、小胞体ストレスセンサーの１つであるIRE1αは膵臓β細胞中でPDIファミリータンパク質の発現量の維持に働いているおり、その機能はプロインスリンの効率良い折りたたみに必要であることを見出し、論文として発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、主に、２つのアプローチによって研究を進めている。第１のアプローチでは膵臓で高発現しているPDIファミリータンパク質の生理的な基質を同定することによって分泌タンパク質を大量に生産する膵臓におけるジスルフィド形成システムを理解することを目的にしている。平成29年度までに、膵臓で特異的に発現しているPDIpは消化酵素を産生する組織で特異的に発現し、種々の消化酵素と分子間のジスルフィド結合を介して相互作用すること、エラスターゼ前駆体の凝集体形成を抑制する働きを持つこと、更に、エラスターゼ前駆体の正しい折りたたみを促進する能力をもつこと等を明らかにした。これは、膵臓で高発現しているPDIファミリータンパク質であるPDIpの生理機能を初めて明らかにしたものであり、現在、論文の投稿に向けた作業を進めている。第２のアプローチでは、低酸素条件下ジスルフィド結合形成に働くシステムを理解するためにVEGFと共有結合中間体を形成する酵素の同定を試みた。VEGFは二量体を形成して初めて活性型になる。よって、二量体形成を指標にフォールディングを評価することができる。HeLa細胞中でVEGF をプラスミドから発現させると、VEGFは好気的条件下では、二量体を形成したが、嫌気的条件下では、二量体を形成できなかった。マウス個体中では、VEGFは嫌気条件下でも正しく折りたたまれて機能を発揮する。よって、嫌気的条件下VEGFが正しく折りたたまれるためには、おそらくは、特異的な因子の発現が必要であることが示唆される。そこで、様々なPDIファミリー遺伝子を共発現させその影響をしらべたが、VEGFの二量体化を促進できる酵素は見いだせなかった。今後は以上の情報を、VEGFの嫌気的条件下における立体構造形成に必要な因子の探索に役立てたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究課題における平成29年度までの解析から、膵臓で高発現しているPDIファミリータンパク質であるPDIpには、消化酵素エラスターゼ前駆体タンパク質の正しい立体構造形成を促進する働きがあることが判明した。現在、研究の完成度を高めるための追加実験と論文の執筆を同時に進行させており、追加実験が終わり次第、原稿を取りまとめ、投稿する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究課題における平成29年度までの解析から、膵臓で高発現しているPDIファミリータンパク質であるPDIpには、消化酵素エラスターゼ前駆体タンパク質の正しい立体構造形成を促進する働きがあることが判明した。現在、論文を準備中であるが、研究の完成度を高めるための追加実験をし、結果をより精緻にして論文をまとめる必要があるため、補助事業期間の延長が必要になった。研究費は、遺伝子を動物細胞にトランスフェションするための試薬、タンパク質を検出するための抗体、動物細胞の培養や維持に必要な試薬や器具の購入に使用する。その他、論文発表のための費用を計上している。
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