研究課題
平成28年度当初は、SaCel6B野生型酵素の発現・精製と、前年度10種類構築したSaCel6B変異酵素のなかで、プロセッシブな分解反応を示すために重要であると予測されたトリプトファン残基2つをそれぞれアラニンに置換した変異酵素（2種類）の発現・精製をおこなった。そして野生型酵素を含めた3種それぞれで、不溶性基質であるリン酸膨潤セルロース・結晶性セルロースに対する分解活性及び吸着活性を調べた。その結果、2種の変異酵素は野生型酵素と比較して、不溶性基質に対する分解活性が低下する一方、その吸着活性には変化がないことが明らかとなった。また野生型酵素を含めた3種酵素の、結晶性セルロース分解をHS-AFMで観察したところ、変異酵素では野生型と比較して結晶性セルロースに対する連続的な分解反応（すなわちプロセッシブな分解反応）をしめす分子がほとんど観察されなかった。これらの実験結果は、SaCel6Bを構成するアミノ酸残基の中で、プロセッシブな分解反応を示すために重要であると予測されたトリプトファン残基2つが実際にSaCel6Bのプロセッシビティに強く影響していることを示唆するものであると考えられた。またこれら酵素学的実験、HS-AFM観察の他に、平成28年度ではSaCel6B野生型酵素の結晶化条件の検討をおこなった。SaCel6Bは2つのドメイン（基質吸着ドメインと活性ドメイン）からなる酵素であるが、全てのドメインを含む形での結晶化を試みた。しかしながら今回検討した結晶化条件では、結晶の生成は確認することができなかった。以上の研究成果の一部などを、糖質加水分解酵素の研究成果としてまとめ、国内学会3件で発表した。
2: おおむね順調に進展している
SaCel6B野生型酵素と、2種類の変異酵素（プロセッシブな分解反応を示すために重要であると予測されたトリプトファン残基2つをそれぞれアラニンに置換）の発現・精製をおこなった。そしてそれぞれの、不溶性基質に対する分解活性及び吸着活性を調べた。不溶性基質としてリン酸膨潤セルロースおよび結晶性セルロースを用いた。その結果、リン酸膨潤セルロースの分解及び吸着活性、結晶性セルロースに対する吸着活性については、野生型・変異型の間に大きな相違は認められなかった。一方で結晶性セルロースの分解活性については、野生型と比較して2種の変異酵素は分解活性が半分以下に低下していた。次に野生型酵素と2種類の変異酵素の、結晶性セルロース分解の様子をHS-AFM観察したところ、変異酵素では野生型酵素と比較してプロセッシブな分解反応をしめす分子がほとんど観察されないことが明らかとなった。これら生化学実験およびHS-AFM観察の結果は、SaCel6Bの活性トンネルの入り口付近に存在する2つのトリプトファン残基が、プロセッシブな分解反応のために重要であるとの予測を強く支持するものであると考えられた。一方で、カビ由来のセルラーゼであるセロビオハイドロラーゼ１の、活性トンネル入り口付近に存在する芳香族アミノ酸残基をアラニンに置換した変異酵素の結晶性セルロース分解の様子をHS-AFM観察した結果では、全くプロセッシブな分解反応を示す分子が観察されないことが明らかとなっている。これはカビ由来セルラーゼと放線菌由来セルラーゼの何らかの性質の違いを示すものと考えられる。またSaCel6B野生型酵素の結晶化条件の検討をおこなった。市販の酵素結晶化条件探索キットを用い、SaCel6Bの、2つのドメインを含む完全な形での結晶化を試みた。しかしながら今回検討した結晶化条件では、結晶の生成は確認することができなかった。
平成28年度は、SaCel6B野生型酵素と、2種類の変異酵素（プロセッシブな分解反応を示すために重要であると予測されたトリプトファン残基2つをそれぞれアラニンに置換）のそれぞれの性状について比較実験をおこなった。不溶性基質に対する分解及び吸着活性の比較をおこない、予測を支持するような実験結果を得た。平成29年度では、生化学的な実験についてはそれぞれの酵素のオリゴ糖やメチル化糖などの水溶性基質に対する分解活性の比較をおこなう予定である。HS-AFM観察実験については、平成27年度、28年度のデータで必要十分であると考えられる。変異酵素の一分子統計解析は、野生型酵素と比較してプロセッシブな分解反応を示す酵素分子が少なく、データの積み増しに労力が掛かりすぎる為、これ以上はおこなわないことと判断した。また平成29年度では、前年度に引き続いてSaCel6B野生型酵素の結晶化条件の検討をおこなっていく。前年度検討した結晶化条件では、結晶の生成は確認することができなかった。そこで酵素の精製条件の見直しから始める。また前年度では2つのドメインを含む完全な酵素全体での結晶化を試みたが結晶の生成は確認できなかった。この為、平成29年度では、基質吸着ドメインを外した活性ドメインだけの結晶化を試みる。活性ドメインのみのX線結晶構造では、SaCel6Bとアミノ酸相同性の高いセルラーゼ8種についての解析結果があるので、これを参考にする予定である。そしてSaCel6Bのリガンドフリー構造や、オリゴ糖を含む複合体の構造決定を目指す。
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