| 研究課題/領域番号 |
15K07390
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
木村 泰久 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (10415143)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ABCタンパク質 / 善玉コレステロール / 高密度リポタンパク質 / HDL / ABCA1 / ABCG1 / 脂質輸送 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は善玉コレステロールとして知られる高密度リポタンパク質(HDL)の形成機構を分子レベルで解明しようとするものであり、精製タンパク質を用いた再構成系による生化学的解析を中心に研究を遂行している。HDLは脂質輸送型のABCタンパク質(ABCA1,ABCG1)がApoA-Iに脂質を輸送して形成される。本研究ではこの輸送過程を解析し、HDLが形成される反応の初期段階を明らかにする。平成27年度の研究ではナノディスク再構成系の構築と、再構成した脂質輸送型ABCタンパク質とApoA-Iとの相互作用を評価する実験系の構築を行った。このうち脂質輸送体型ABCタンパク質のナノディスクへの再構成ではヒトABCA1について重点的に再構成手法の最適化を行った。この結果、精製ABCA1とディスクを形成する膜足場タンパク質(MSP)のストイキオメトリーを調節する事で、安定的にディスクを形成させる手法が確立できた。また膜足場タンパク質の種類についても検討を行い、一般的に使われる足場タンパク質よりも大きな粒径のディスクを形成する足場タンパク質を用いた場合に高い再構成効率を示すことを見出した。さらに再構成したディスク中でABCA1のATP加水分解活性を検出できたことから、活性な3次元構造を保った状態でABCA1を再構成できていることが確認できた。以上の結果から、初年度に予定していたナノディスクへの再構成系確立は期待以上の進捗が得られた。そこで、当初2年度目に予定していたナノディスクに再構成したABCA1とApoA-Iとの親和性測定を開始した。相互作用はSPR法で解析しており、ナノディスクをセンサー上に固定するところまでは再現性が得られているが、ApoA-Iの非特異的吸着等が問題となり、親和性の測定には至っていない。現在、結合条件の精査を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度の研究では当初予定していたナノディスク再構成系をほぼ確立できた。また、2年度目に予定していたApoA-Iとの相互作用解析の予備実験を開始できたことから、概ね順調に推進できたと考えている。一方、ApoA-Iとの相互作用解析ではApoA-IのSPR分析が困難な現状であり、当初予定していなかったSPR法以外の解析手法の検討が必要であることが明らかとなった。現状では予想以上の進捗を得られているが、概ね順調に進捗していると評価している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度の研究ではナノディスク再構成ABCA1のApoA-Iとの相互作用様式の解明とHDL形成時の活性測定を予定している。HDL形成時の活性測定に関しては、再構成するナノディスクの脂質成分をコントロールし、どの様な脂質が優先的に輸送されるかをATP加水分解活性を指標に検討する。一方、相互作用様式の解明においては、上記項目にも記したようにABCA1とApoA-Iの相互作用をSPR法で現状検出できていないことから、SPR法の条件検討を最重点課題として取り組むと共に、クロスリンク法など全く原理が異なる手法の検討も行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究初年度ではナノディスク再構成系の構築が予定よりも早く終了し、培地等の消耗品費が予想よりも少なかった。この為、当初培地、精製用カラムなど消耗品に使用する予定であった消耗品費を次年度に繰り越すこととした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
初年度の研究においてSPR法による解析が予想以上に困難であり、重点的な条件検討が必要であることが明らかとなった。今年度は初年度に繰り越した資金および当初予定の交付金額をあわせて、SPR法の条件検討に必要なセンサーチップ等の消耗品構築を行う計画である。
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