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2015 年度 実施状況報告書

キノン補酵素形成に関与する新規トリプトファン水酸化酵素の精密反応解析

研究課題

研究課題/領域番号 15K07391
研究機関大阪大学

研究代表者

岡島 俊英  大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (10247968)

研究分担者 中井 忠志  大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (00333344)
研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2018-03-31
キーワードモノオキシゲナーゼ / FAD / X線結晶構造解析 / 分子内架橋 / チオエーテル結合
研究実績の概要

キノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素(QHNDH)の生合成を制御するオペロンは、酵素サブユニット以外にもFAD 含有モノオキシゲナーゼをコードするqhpG 遺伝子を含んでいる。QhpG タンパク質は、QHNDH の低分子量γサブユニットにおいて、Trp 残基側鎖インドール環を特異的に水酸化し、キノン補酵素形成の初発反応を引き起こすと考えられている。その反応機構を解明することが本研究の目的である。これまでに先行実験において判明したPseudomonas putida由来QhpGの結晶化条件をさらに最適化し、安定的に結晶を得る条件を見出した。新たに調製した結晶を用いてX線回折データを収集した結果、これまでの2.7 オングストロームに比較して、2.5 オングストロームまで分解能を改善することに成功した。位相決定のために、NaBr、PbCl2などの重原子試薬でソーキングし、重原子同型置換法、SAD及びMAD法による解析を行い、まだ不十分ではあるが解を得ている。また、試験管内反応系の構築のために、シトクロムb5 還元酵素、NADH、およびフェノサフラニンなどの電子伝達色素を加え、還元された色素を介して、大気条件下でもPpuQhpG のFAD が連続的に還元されるようにする系の構築に成功した。本系にペプチド基質を加え、生成物を質量分析した結果、水酸化されたペプチドは得られていないが、ジスルフィド結合ではない何らかの共有結合で架橋された生成物の形成を見出した。さらに、P. putidaの架橋された全長QhpC、すなわち生理的条件下における基質を調製するため、QhpD/QhpCの共発現系の構築にも成功した。引き続き、QhpGと全長QhpCとの反応も解析する予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

反応系構築ならびに反応機構を解析するための生成物分析に関しては、想定以上に進展している。X線結晶構造解析については、分解能の改善、重原子標識結晶の調製に加え、まだ不十分ではあるが位相の決定にも成功しているなど、ほぼ想定通りの進展があった。

今後の研究の推進方策

当面、X線結晶解析によるQhpGの構造決定の早期の完結を第一の目標とする。その上で、予定通りに速度論的解析にもとづく詳細な反応機構の解明を行う。

次年度使用額が生じた理由

結晶化条件の最適化が順調に進展し、想定していたよりも物品費の使用金額が減額されたため。

次年度使用額の使用計画

より一層、研究を進展させるべく、X線結晶解析データ収集のための出張日数を増やす予定である。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2016 2015 その他

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] The radical S-adenosyl-L-methionine enzyme QhpD catalyzes sequential formation of intra-protein sulfur-to-methylene carbon thioether bonds.2015

    • 著者名/発表者名
      Nakai T, Ito H, Kobayashi K, Takahashi Y, Hori H, Tsubaki M, Tanizawa K, Okajima T.
    • 雑誌名

      J. Biol. Chem.

      巻: 290 ページ: 11144-11166

    • DOI

      10.1074/jbc.M115.638320

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Probing the catalytic mechanism of copper amine oxidase from Arthrobacter globiformis with halide ions.2015

    • 著者名/発表者名
      Murakawa T, Hamaguchi A, Nakanishi S, Kataoka M, Nakai T, Kawano Y, Yamaguchi H, Hayashi H, Tanizawa K, Okajima T.
    • 雑誌名

      J. Biol. Chem.

      巻: 290 ページ: 23094-23109

    • DOI

      10.1074/jbc.M115.662726

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [学会発表] ペプチドのマルチサイト分子内架橋形成を触媒するラジカルSAM酵素の反応機構2016

    • 著者名/発表者名
      岡島 俊英、中井 忠志、小林 一雄、高橋 康弘、堀 洋、鍔木 基成、谷澤 克行
    • 学会等名
      日本農芸化学会2016年度大会
    • 発表場所
      札幌
    • 年月日
      2016-03-28
  • [学会発表] ペプチドを分子内架橋するラジカルSAM酵素の反応機構2015

    • 著者名/発表者名
      岡島俊英, 中井忠志, 小林一雄, 高橋康弘, 堀洋, 鍔木基成, 谷澤克行
    • 学会等名
      BMB2015
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2015-12-04
    • 招待講演
  • [学会発表] ペプチドの翻訳後修飾を触媒するラジカルSAMスーパーファミリー酵素2015

    • 著者名/発表者名
      中井忠志, 小林一雄, 高橋康弘, 堀洋, 鍔木基成, 外山博英, 谷澤克行, 岡島俊英
    • 学会等名
      BMB2015
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2015-12-01
    • 招待講演
  • [備考] QHNDH (Quinohemoprotein amine dehydrogenase)

    • URL

      https://www-kofu.jsps.go.jp/kofu1/shinsei/ssoLogonCheck.do

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公開日: 2017-01-06  

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