| 研究実績の概要 |
Ps. putidaキノヘムタンパク質アミン脱水素酵素の小サブユニットQhpCには、Cys37およびTrp43残基から翻訳後修飾によって形成された補酵素cystein tryptophylquinone (CTQ)が存在する。その形成機構の解明を目指して、生合成に必須なFAD依存性モノオキシゲナーゼQhpGの構造決定と生化学的な機能解明を進めた。最終年度の大きな成果として、研究期間を通じての目標でもあったQhpGの結晶構造の決定に成功した。得られた全体構造は、約350残基のN末端側触媒ドメインと約80残基のC末端側基質結合ドメインから構成されていた。触媒ドメインには、分子表面からFAD近傍に続くチャネルが存在し、そこにCTQ前駆体となるTrp43を含むループが結合すると予測された。
加えてQhpGとQhpCが反応し、どのような生成物が形成されるのか、前年度から引続いて反応物の質量分析をおこなった。その結果、FAD還元後に分子状酸素を加えることによって、Trp43を含む領域に２個の酸素原子が導入されることがわかった。１個の酸素原子が導入された中間状態も見出されたことから、２回の酸化反応を繰り返し、前駆体Trpインドール環の6,7位が水酸化されていることが推測された。結晶構造に基づく複合体モデルを用いて詳細に検討した結果、FADの近傍にTrp43インドール環が位置することによって、酸素原子が付加され、水酸化反応が起きることが予測された。１段階目の水酸化の後に、水素結合の架け替えが起き、２箇所に水酸化がおきることが予測された。この反応機構は、最終年度に行った変異型QhpGの解析によっても裏付けられた。最終的なCTQ形成は、ペリプラズムにおいて、Cys37がインドール環へ求核攻撃することによって、架橋が形成され、協奏的に酸化されることによると考えられた。
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