| 研究実績の概要 |
Tk-subtilisinによるプリオンの分解条件を決定するため、酵素濃度や反応温度を変えて、羊のプリオン病であるスクレイピー感染型マウス脳ホモジネート (RML株)を用いて分解実験を行った。60℃で1時間処理したところ、Tk-subtilisinによる分解産物にのみ、PrPのC末端を含む11kDa以下の断片が検出された。この中間体は非感染脳ホモジネートを分解した際にも検出されたことから、Tk-subtilisinがその活性の強さからPrPを非特異的に分解した結果生じたものである可能性が示唆された。さらに、反応時間3条件、酵素濃度2条件の組合せを検討した。酵素分解産物中のPrPを確認するため、抗PrP抗体である6D11を用いてウエスタンブロッティングを行った。この結果、60℃においてはPK、Tk-subtilisinともにPrPScの分解が進まないことが分かった。80℃以上ではTk-subtilisinによるPrPScの分解が進んでいることが確認できたため、次にマウスの神経芽細胞であるN2a細胞を用いた感染性試験を行った。細胞に酵素分解物を反応させたところ、熱処理のみのものでは接種8日後に細胞内にPrPScの蓄積が確認されたのに対し、その他の条件ではほとんどPrPScのシグナルが確認出来なかった。露光時間を長くすると、20μg/mg-protein, PK処理の条件においてはPrPScが少量確認されたのに対し、同濃度のTk-subtilisin処理ではPrPScが検出されなかった。また、100℃のPrP分解物を感染させた細胞においてはPrPScが蓄積されている条件が見られず、定量的な評価が出来ないことが分かった。これらの結果から、20μg/mg-protein, 80℃の条件においてTk-subtilisinによる分解が有意に感染能に影響を与えているということが示唆された。
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