研究課題
アスコルビン酸は、植物に最も豊富に含まれる抗酸化物質で、植物にとって必要不可欠な物質である。高等植物のアスコルビン酸において、複数の生合成経路の存在が明らかにされているが、マンノース経路が主経路とされている。熱帯植物であるアセロラ(Malpighia glabra)は、アスコルビン酸を大量に含んでいる。しかし、アスコルビン酸の大量集積機構は不明であった。これまでの研究で、アセロラにおけるマンノース経路のアスコルビン酸生合成酵素遺伝子のmRNA発現が非常に高いことがわかっている。GMP-D-mannose pyrophosphorylase (GMP)は、アスコルビン酸生合成のマンノース経路における最初の反応を触媒する酵素として非常に重要である。アセロラGMPのmRNA発現とプロモーター活性は、シロイヌナズナのものと比べそれぞれ37倍、24倍高いことを明らかにした。つまり、アセロラにおけるアスコルビン酸生合成酵素遺伝子プロモーターの高転写活性化能が、生合成酵素mRNA発現を促し、アスコルビン酸高集積に繋がると考えられる。GMPプロモーター領域の転写活性化能の評価には、ルシフェラーゼ遺伝子によるレポーターアッセイ系を用いた。GMP遺伝子の上流1200 bpのプロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を融合し、ルシフェラーゼの発光を測定することによりプロモーター活性を評価した。ディリーション解析から、GMPプロモーターの転写活性には、-1200 ~ -600 bpの領域が必要であることを明らかにした。結果的に、アセロラGMPプロモーターの -1100 bp ～ -1080 bpの領域内に存在するabscisic acid response element (ABRE) 様配列GAAGTTがGMPの高転写活性に関与している可能性が示唆された。
2: おおむね順調に進展している
これまでの研究で、アセロラにおけるマンノース経路のアスコルビン酸生合成酵素遺伝子のmRNA発現がいずれもシロイヌナズナのアスコルビン酸生合成酵素遺伝子のmRNA発現に比べ非常に高いことを示した。今回、アスコルビン酸生合成のマンノース経路における最初の反応を触媒する酵素として非常に重要なGMP-D-mannose pyrophosphorylase (GMP)に着目し解析した結果、アセロラGMPのmRNA発現およびプロモーター活性がシロイヌナズナのものと比べ非常に高いことを明らかにした。このことから、アセロラでは、アスコルビン酸生合成酵素遺伝子プロモーターの高転写活性化能が、アスコルビン酸生合成酵素のmRNA発現を促し、結果的に、アスコルビン酸生合成が高まって、アスコルビン酸含量が非常に高くなることがわかった。このことは、植物の種間でのアスコルビン酸量の相違が、アスコルビン酸の生合成酵素遺伝子の転写レベルでの発現機構の相違により説明できることを示唆する。また、アセロラGMPの強発現のためのシス因子が-1100 bp ～ -1080 bpに存在することを示唆し、そのシス領域内に存在するabscisic acid response element (ABRE) 様配列GAAGTTが、GMPの高転写活性に関与している可能性が示唆された。このように、アセロラのアスコルビン酸生合成酵素遺伝子の高転写活性に関わる分子メカニズムが少しずつ解明されており、「アセロラが、なぜ、どのような機構で、アスコルビン酸を高集積できるか」という当初の研究目的を達成しうる研究成果が得られており、研究が、計画通り、順調に進捗していると判断した。
アセロラにおけるアスコルビン酸高集積機構について調べた結果、アスコルビン酸生合成酵素遺伝子プロモーターの高転写活性が、アスコルビン酸生合成酵素のmRNA発現を促し、アスコルビン酸高集積に繋がると考えられる。これまでの研究で、アセロラGMP遺伝子プロモーターの高転写活性にABREがシス因子として関わっている可能性が示唆された。ABREは、DRE1COREと同様、トランス因子ERF98が標的とするシス因子であることが示されている。また、ABREを標的とするトランス因子ERF98には、発現プロファイルや認識配列が異なる複数のERF98ホモログの存在が報告されている。今後、ERF98や、対象となりうる転写因子ホモログについて網羅的に解析したい。アセロラはアスコルビン酸を豊富に含む品種が一般的であるが、ブラジルでは低アスコルビン酸含有品種が栽培されている。両者の比較により、アセロラのアスコルビン酸高集積機構が明確になると考えられる。すなわち、GMP、GDP-D-mannose-3’,5’-epimerase (GME)およびGDP-L-galactose phosphorylase (GGP)のmRNA発現が高アスコルビン酸含有品種で非常に高い可能性がある。実際に、これら３つの遺伝子（GMP、GME、GGP）の発現を転写レベルにおいて調べ、これらの遺伝子の高発現がアセロラにおけるアスコルビン酸高集積の要因であるかどうかを調べたい。まず、まだ明らかになっていないアセロラのGME、GGP遺伝子の5’上流域の配列を明らかにし、これまでに解析したGMP遺伝子に加え、GME、GGP遺伝子の高発現メカニズムについても解析・解明したい。
小額が残り、年度内に、特に必要なものを買うだけの金額には達せず、次年度に使用することにした。
消耗品として試薬等を買う予定である。
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African Journal of Agricultural Research
巻: 10 ページ: 2274-2285
http://home.hiroshima-u.ac.jp/enzyme/esaka.html
