イネ種子の発芽調節におけるエチレンシグナル伝達系のレドックス制御

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K07400
• 研究機関: 京都府立大学
• 研究代表者: 森田 重人 京都府立大学, 生命環境科学研究科(系), 講師 (20295637)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 種子 / 発芽 / エチレン / レドックス制御 / イネ

研究実績の概要

植物の発芽は植物ホルモンであるエチレンにより調節されているが、イネを初めとする主要穀物ではその調節機構について不明な点が多い。筆者はレドックス制御に関わる酵素グルタレドキシンに着目し、これまでにイネグルタレドキシンGRXC2;2が発芽調節に関与していることを明らかにした。また酵母two-hybridスクリーニングによりGRXC2;2の相互作用因子としてERS1を同定している。本研究ではGRXC2;2とERS1の相互作用による発芽調節機構の解明を目的とし、平成27年度には以下の３つの実験を行った。
１　GRXC2;2形質転換イネの解析：　筆者は、これまでにGRXC2;2の過剰発現による発芽抑制を観察している。GRXC2;2による発芽調節にエチレンが関与しているかどうかを明らかにするため、GRXC2;2過剰発現イネの種子を、エチレン前駆体（ACC: 1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸）で処理し、発芽が促進されるかを調査した。その結果、過譲発現系統ではエチレンによる発芽の促進がコントロール系統に比べ低下していた。これによりエチレンによる発芽調節にGRXC2;2が関与していることが示唆された。
２　GRXC2;2とERS1の相互作用の解析：　ERS1がイネ細胞内で実際にGRXC2;2と相互作用することをBiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) 法により確認するため、両者を植物細胞で発現するコンストラクトを作製中である。今後イネ培養細胞プロトプラストでそれらを発現させ、相互作用を調査する。
３　形質転換イネの作出：　これまでに作出しているGRXC2;2発現抑制系統の後代 (T1世代) を育成し、発現抑制を確認した。平成28年度にさらにT2世代を育成し種子を増殖させ、以降の実験に必要な量を確保する。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

平成27年度の研究実施計画では、BiFC法によるGRXC2;2とERS1の相互作用の確認を予定していたが、現在コンストラクトの作製途中であり、植物培養細胞での発現と相互作用の観察は未実施である。
また研究実施計画では、ERS1の発現抑制形質転換イネの作出を予定していたが、未着手である。これは上記のGRXC2;2とERS1の相互作用を確認した後、実施する計画であったためである。

今後の研究の推進方策

平成27年度計画で未実施であるGRXC2;2とERS1の相互作用確認を早急に実施する。またこの確認が済んだ後、ERS1の発現抑制系統作出を予定していたが、当初計画から遅れているため、並行して発現抑制系統作出を進める。なおERS1発現抑制系統については、当初計画では平成28年度で後代の育成・種子増殖を行い、平成29年度に発芽・初期生長を調査するとしていたが、これらをそれぞれ平成29年度、30年度に実施する。
またERS1がGRXC2;2により酸化還元を受けるかどうかを調査するために、平成28-29年度にERS1、GRXC2;2、変異型GRXC2;2の組換えタンパク質を作製し、in vitroで反応させる実験を計画している。組換えタンパク質の発現・精製は、タンパク質の種類によっては技術的に難航する場合がある。よってこの問題を回避するために研究計画を変更し、イネ培養細胞プロトプラストでERS1とGRXC2;2を共発現させ、両者が反応するかどうかを調査する。イネ培養細胞プロトプラストの発現系は、BiFC実験でも行うことから既に当研究室で実施可能な状況となっている。平成28年度にERS1、GRXC2;2、変異型GRXC2;2を発現するコンストラクトを作製し、29年度にそれらをプロトプラストに導入してERS1の酸化還元状態を調査する。
また平成28年度は、GRXC2;2発現抑制系統について ACC処理によるエチレン応答の調査を予定している。これについては、年度前半でT2世代を育成し、種子を増殖させた後に年度後半で行う。
上記以外の実験については、平成28年度の当初計画通り、酸化還元活性を持たない変異型GRXC2;2の過剰発現系統の作出と、ERS1に対する抗体の作製を進める。

次年度使用額が生じた理由

上記の通り平成27年度は、研究計画に対して進捗がやや遅れている。そのため試薬・器具などの物品費が予定を下回る金額となったため。

次年度使用額の使用計画

計画よりも遅れている実験については１年遅れで実施するため、それに伴い物品費が増加する予定である。また一部研究計画を変更するため、実験手法の変更に伴う試薬・器具等の支出増加を物品費で賄う予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Expression of a rice glutaredoxin in aleurone layers of developing and mature seeds: subcellular localization and possible functions in antioxidant defense (2015)
  • 著者名/発表者名: Shigeto Morita, Yuki Yamashita, Masayoshi Fujiki, Rie Todaka, Yuri Nishikawa, Ayaka Hosoki, Chisato Yabe, Jun’ichi Nakamura, Kazuyoshi Kawamura, I Nengah Suwastika, Masa H. Sato, Takehiro Masumura, Yasunari Ogihara, Kunisuke Tanaka, Shigeru Satoh
  • 雑誌名: Planta 巻: 242 ページ: 1195-1206
  • DOI: DOI 10.1007/s00425-015-2354-9
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] イネグルタレドキシンOsGRXC2;2による発芽と初期生長の抑制 (2016)
  • 著者名/発表者名: 森田重人、足立哲、中村淳一、足立聖佳、増村威宏、佐藤茂
  • 学会等名: 第57回日本植物生理学会年会
  • 発表場所: 岩手大学（岩手県盛岡市）
  • 年月日: 2016-03-18 – 2016-03-20
• [学会発表] イネの種子発芽におけるグルタレドキシンOsGRXC2;2の機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中村淳一、足立聖佳、増村威宏、佐藤茂、森田重人
  • 学会等名: 日本農芸化学会中部・関西支部合同大会
  • 発表場所: 富山県立大学（富山県射水市）
  • 年月日: 2015-09-19 – 2015-09-20