| 研究課題/領域番号 |
15K07401
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| 研究機関 | 東京電機大学 |
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研究代表者 |
夏目 亮 東京電機大学, 工学部, 教授 (60637651)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | βアミノ酸 / 光学分割 / アミノアシラーゼ / 結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
βフェニルアラニンの光学分割に役立つR体特異的βフェニルアラニンアミノアシラーゼ（R-βPheAA）の構造機能相関を明らかにする目的で、H27年度は構造解析、具体的にはBurkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶構造解析に重点的に取り組んだ。また、Variovorax属細菌由来R-βPheAAについても研究を進めた。
１．Burkholderia属細菌由来R-βPheAA
N末端His-tag融合型R-βPheAA（His-R-βPheAA）に加えてC末端His-tag融合型R-βPheAA（R-βPheAA-His）の発現・精製系も構築し、両組換え蛋白質の結晶化、ならびにセレノメチオニン置換した両組換え蛋白質の結晶化に取り組んだ。得られた結晶の回折像を放射光を用いて収集し、各結晶の結晶学的パラメータを決定した。さらに、セレノメチオニン置換R-βPheAA-Hisの回折データを用いたSe-SAD法により初期位相を決定し、R-βPheAA-Hisの初期モデルを構築した。これをモデルとした分子置換法により、NativeのHis-R-βPheAAおよびR-βPheAA-Hisの結晶構造を2.9Å分解能で決定した。現在、結晶構造の精密化を進めている。His-R-βPheAA、R-βPheAA-His、タグフリー型R-βPheAA、3種類の組換え酵素の基本的な生化学的性質の解析もほぼ完了した。
２．Variovorax属細菌由来のR-βPheAA
His-R-βPheAAに加えてR-βPheAA-Hisの発現・精製系を構築して結晶化に取り組んだ結果、R-βPheAA-Hisについては結晶化条件を見つけることに成功した。His-R-βPheAA、R-βPheAA-His、タグフリー型R-βPheAA、3種類の組換え酵素の生化学的解析も順調に進んだ。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
Burkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶構造解析が本研究課題の最重要課題であり、H27年度の主な実施計画は、Burkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶化条件を確立し、結晶学的パラメータを決定することであった。H27年度からの放射光共同利用課題としてBurkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶構造解析の課題が採択され、既に得られていたN末His-tag融合型蛋白（His-βPheAA）の結晶の測定を行った。NativeのHis-βPheAAは良好な回折像を得ることが出来たがセレノメチオニン置換His-βPheAAはあまり良い回折像を得ることが出来なかったため、C末端His-tag融合型R-βPheAA（R-βPheAA-His）の発現・精製・結晶化にも取り組んだ。その結果、研究が当初計画よりも順調に進み、比較的良質なセレノメチオニン置換R-βPheAA-Hisの結晶が得られるようになり、結晶構造解析にも成功した。また、Variovorax属細菌由来R-βPheAAについてもR-βPheAA-Hisの発現・精製・結晶化に取り組み、まだ最適化は不十分ではあるものの結晶化条件を見出すことができた。これらの成果は、Burkholderia属細菌由来ならびにVariovorax属細菌由来のR-βPheAAの結晶構造解析について、当初計画を半年以上前倒しで研究が進められたことを意味している。そこで現在までの進捗状況として、「（１）当初の計画以上に進展している。」を選択した。両微生物由来R-βPheAAの生化学的性質解析も順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
＜１．Burkholderia属細菌由来R-βPheAA＞
測定条件を改良し、より高分解能な回折データの収集と構造精密化に取り組む。また、基質をソーキングした結晶の構造解析も行い、基質結合部位を実験的に同定することを目指す。基質結合部位を形成するアミノ酸残基を洗い出し、部位特異的変異の導入、部位特異的変異体の生化学的解析を進め、活性中心残基、基質認識残基を同定する。反応性が低下した変異体を用いて、基質／基質アナログ、あるいは反応産物／反応産物アナログとの共結晶構造解析も試みる。これらを総合して、酵素反応触媒機構、基質特異性決定機構等、構造情報に立脚して当該酵素の特性を明らかにする。
＜２．Variovorax属細菌由来R-βPheAA＞
H28年度からの放射光共同利用課題としてVariovorax属細菌由来R-βPheAAの結晶構造解析の課題が採択されたため、既に得られている結晶について、放射光を用いて回折像の収集を試みる。結晶学的パラメータの決定を試みつつ、良質な回折像が得られるよう、結晶化条件の改良・最適化に注力する。Burkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶構造をモデルとした分子置換法による結晶構造解析がうまくいかないことも想定し、セレノメチオニン置換Variovorax属細菌由来R-βPheAAの結晶化にも取り組む。His-R-βPheAA、R-βPheAA-His、タグフリー型R-βPheAA、3種類の組換え酵素の生化学的解析を進める。
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