| 研究課題/領域番号 |
15K07402
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪市立工業研究所 |
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研究代表者 |
駒 大輔 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 環境技術研究部, 研究員 (80443547)
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| 研究分担者 |
田中 重光 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究員 (20509822)
森芳 邦彦 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 環境技術研究部, 研究主任 (30416367)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | Chromosome / GFP / Red recombinase / 相同組換え / 大腸菌 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は遺伝子を大腸菌に導入して蛍光を発するための環状DNAのもととなるプラスミドを作製した。すなわち、遺伝子発現を増幅するためのT7RNAポリメラーゼ遺伝子を構成性のプロモーターに連結し、一方、大腸菌用にコドンを最適化したGFP遺伝子をT7RNAプロモーターに連結して、これらを1つのプラスミド上に配置した。このプラスミドで大腸菌を形質転換することで、誘導剤を添加しなくても大腸菌が緑色蛍光を発することを確認した。また、このプラスミドを適切な制限酵素で処理してセルフライゲーションすることで、T7RNAポリメラーゼ遺伝子とGFP遺伝子のみからなる非プラスミド型の環状DNAを作製した（プラスミド上の複製起点と薬剤耐性遺伝子を除いたもの）。この非環状型DNAを用いて大腸菌が蛍光を発するかどうか現在確認している途中である。
さらにGFP遺伝子をλファージの組み換え酵素であるRed recombinaseに変更するためのプライマー、およびT7RNAポリメラーゼ遺伝子の発現に関する構成性プロモーターの種類を変更するためのプライマーなどを設計した。これらのプライマーを用いて、次年度で相同組換えのための非環状型DNAを作製する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
構成的に発現するT7RNAポリメラーゼ遺伝子とT7RNAプロモーターにより高発現するGFPを同時にコードするプラスミドを作製する際に、形質転換体がなかなか得られずに実験が遅れた。最終的に低コピーのプラスミドを用いることで問題を解決した。
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| 今後の研究の推進方策 |
非プラスミド型の環状DNAを用いて大腸菌が緑色蛍光を発することを確認する。さらにGFP遺伝子を相同組換え酵素に変更し、非プラスミド型の環状DNAを用いて大腸菌内で効率的に相同組換えを起こして、目的遺伝子を染色体DNAに導入できることを確認する。その際に、T7RNAポリメラーゼ遺伝子を発現させるための構成性プロモーターをさまざまに変更することで、効率的に遺伝子を導入できる系を構築する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度以降に実験に必要な装置を購入するために未使用金を計上した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
様々な温度で形質転換した微生物を培養する必要が生じるため、翌年度分として請求した助成金と併せて、微生物の培養を行うための装置を購入する（50万円以下）。
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