| 研究課題/領域番号 |
15K07402
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪産業技術研究所 |
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研究代表者 |
駒 大輔 地方独立行政法人大阪産業技術研究所, 森之宮センター, 研究主任 (80443547)
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| 研究分担者 |
田中 重光 地方独立行政法人大阪産業技術研究所, 森之宮センター, 研究員 (20509822)
森芳 邦彦 地方独立行政法人大阪産業技術研究所, 環境技術研究部, 研究主任 (30416367)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 相同組み換え / ゲノム編集 / 大腸菌 / 遺伝子組み換え |
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| 研究実績の概要 |
プラスミドフリーなゲノム改変手法の基礎的基盤を確率した。具体的には、レプリコンを有さず、相同組み換えのためのRed recombinaseと、Red recombinaseを一過的に高発現するためのT7RNAポリメラーゼ遺伝子を有する環状DNAを作製した。この環状DNAを大腸菌にエレクトロポレーションで導入し、同時に大腸菌の染色体の特定の座位と相補的な配列を有するGFP遺伝子（PCRで増幅）も導入し、GFP由来の緑色蛍光を発する大腸菌の作製を試みた。しかし、組み換え効率が極端に悪いため、明確な緑色蛍光を発するコロニーが得られなかった（全体のコロニーの数が多すぎ、かつ擬陽性らしきものが多い）。よって、何かしらの菌株の選別を行う仕組みを併せて用いる必要があることが明らかとなった。
一方、T7発現系の高発現の仕組みを利用した構成型T7高発現系を開発した。本発現系が機能することを確認するために、GFP発現菌株、LacZ発現菌株、およびアミノ酸合成に関わる複数遺伝子を発現する菌株に組み込み、それぞれの菌株で本発現系が機能するかどうかを確かめた。リポーターアッセイやリアルタイムPCRを用いた実験で、目的遺伝子が構成的に高発現していることが確認された。これにより、遺伝子発現誘導剤を用いなくても目的遺伝子を高発現することが可能となり、本研究での一過的なRed recombinaseの高発現に非常に役立つと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
論文作成のためのデータ収集を行う必要があったために、研究の進行がやや遅れた。また、新たな課題（遺伝子の導入確率が低い）が発生したため、その解決手段を検討する必要が生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
期間を延長し、当初予定していた最終年度の内容を行う。遺伝子導入効率が低いために、何かしらの手段で菌株を選別する必要があるが、薬剤耐性遺伝子を用いることで、菌株の選別を行う手段を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の課程で新たな課題が発生したために、若干の研究計画の変更があり、研究期間を1年間延長した。生じた繰越し金は、生じた課題の延長期間内での解決のために用いる。具体的には、合成核酸や消耗品などに使う。
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