| 研究課題/領域番号 |
15K07403
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| 研究機関 | 福岡県工業技術センター |
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研究代表者 |
奥村 史朗 福岡県工業技術センター, その他部局等, 専門研究員 (40399671)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 細胞応答 / パラスポリン / ベクリン1 |
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| 研究実績の概要 |
がん細胞特異的毒素タンパク質であるパラスポリン1はがん細胞にアポトーシスを誘導して細胞死に至らしめるが、ヒト正常細胞由来の培養細胞に対しては毒性を示さない。パラスポリン1の受容体候補としてベクリン1が同定され、市販の抗ベクリン1抗体を用いた検討によりベクリン1が細胞膜表面に存在すること、ベクリン1の脂肪膜表面存在量と細胞のパラスポリン1感受性に高い相関性があること、そして抗ベクリン1抗体自体が細胞にアポトーシスを誘導することが判明している。しかしベクリン1の細胞膜表面への局在を示す報告は現在のところなく、細胞膜表面への局在の生理的意義や機構などについては不明な点が多い。
本研究はパラスポリン1の受容体を解明すること、および、有力な受容体候補であるベクリン1に対する抗体が、PS1と同様にがん細胞をアポトーシスに誘導する現象について詳細に検討を行うことにある。2015年度は、まず、すべての実験に必須となる培養細胞実験の環境整備を行い、組換え体大腸菌によるパラスポリン1の組換え体による生産および精製を行った。また、パラスポリン1受容体獲得のための材料となるパラスポリン1感受性がん細胞（HeLa細胞）を大量に培養し-80℃で凍結保存を行った。パラスポリン1受容体候補であるベクリン1の生産については組換え体大腸菌による系と培養細胞による系の両方での構築に取り組んだ。多種類の生物での生産を効率的に行うためGateway (invitrogen)のベクター系を用いて発現用プラスミドを調製し、培養細胞での生産にあたってはこのプラスミドをPEI-Maxを用いて遺伝子導入してベクリン1の生産を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
諸般の事情により培養細胞実験系の再開と実験環境の構築に時間を要したため予定より若干遅れた進捗となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
2016年度は、まず精製したベクリン1でマウスとラットを用いて、抗ベクリン1ポリクローナル抗体を作成する。提案者らの実験室で作成が難しい動物種についても抗体作成サービスによる作成を検討する。また、ヒトと作成動物種間でベクリン1のアミノ酸配列が異なる部分についてペプチド合成を行い、この合成ペプチドを抗原としての抗体作成についても視野に入れる。
次に、主に組換え体のベクリン1によるパラスポリン1活性の抑制を検討する。現在は組換え体ベクリン1は封入体として得られており、可溶化後透析等によりrefoldingが必要であるが、これも凝集体となり、可溶化状態で得られていないため、PS1の活性抑制の検討ができていない。アルギニン添加などrefoldingの改善方法が各種報告されているので、これらを検討するとともに、ドメインごとに作成した組換え体を用いる場合も視野に入れていく。
また、ベクリン1ノックアウト細胞を作製し、そのノックアウト効率とパラスポリン1の細胞死誘導活性との相関について検討を行う。ベクリン1ノックアウトマウスは致死性であるが、細胞レベルではsiRNAなどの手法によりノックアウト可能である。ただし、siRNAでは完全に発現が抑制されるわけではないので、イムノブロッティングによりベクリン1発現量を定量し、パラスポリン1の細胞死誘導活性との相関を検討する。ベクリン1が単独で受容体として働いているとは限らないが、ベクリン1が重要な役割を果たしていればノックアウトにより細胞死誘導活性が抑制されることが期待できる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究進捗が若干遅れたため、試薬・ディスポ実験器具類の購入が予定より少なく、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究の進行に合わせて、試薬・ディスポ実験器具、抗体産生のための実験動物購入等に使用する予定。
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