| 研究実績の概要 |
ミラクリンは酸味を甘味に変換する活性（味覚修飾活性）を有するホモ二量体タンパク質である。遺伝子配列の報告以来、複数の研究グループによって研究が進められてきたが、組換えタンパク質の大量生産が困難であり、分子レベルでの解析は進んでいない。そこで本研究では、ミラクリンとアミノ酸配列の相同性が高いミラクリン類似タンパク質(miraculin-like proteins, MLPs)を研究対象とすることで、ミラクリンの味覚修飾メカニズムを明らかにすることを目指している。
初年度には、MLPsの中でも特にミラクリンとのアミノ酸配列相同性が高いブドウ由来MLP (vvMLP)の大量発現系の構築、精製条件の確立を行い、vvMLPが単量体として存在することを確認した。2年目はvvMLPのX線結晶構造解析、vvMLPへの部位特異的変異導入を行った。ミラクリンにおいて二量体化に必須とされるシステイン残基をvvMLPに導入したところ、変異型vvMLPは不溶化した。3年目（昨年度）は、vvMLPとミラクリンのキメラタンパク質を作製し、ミラクリンにおける糖鎖付加部位の存在が、タンパク質の不溶化と大きく関係している可能性を明らかにした。
本年度は、前年度までに実施できなかった変異型タンパク質の精製・活性解析を実施した。前年度のキメラタンパク質解析結果を受け、さらに細かい部位についてキメラタンパク質を作製し、その性質を解析した。また、2年目に作製した変異型vvMLPの可溶化を試み、可溶化タンパク質を得ることに成功した。これらの変異型タンパク質の精製標品を用いて味覚修飾活性を解析したが、活性は確認できなかった。さらに、ミラクリンの大腸菌での発現条件・生成条件の再調整を行ったところ、可溶性の状態で二量体化したミラクリンを得ることにも成功した。しかし、こちらについても味覚修飾活性は確認できなかった。
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