| 研究課題/領域番号 |
15K07462
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| 研究機関 | 麻布大学 |
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研究代表者 |
小西 良子 麻布大学, 生命・環境科学部, 教授 (10195761)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | アフラトキシン / アフラトキシンM1 / デトキシケーション / ELISA / AFM1の吸着能 / Lactococcus lactis / モノクローナル抗体 |
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| 研究実績の概要 |
カビ毒の一つであるアフラトキシンをモデルとして積極的にヒトへの曝露を抑えるシステマティックな安全性確保手法を新規に開発することを本研究の目的とした。なかでもアフラトキシンM1（AFM1）は乳児、幼児の摂取量が多いことが推測されるため、暴露期間も長く、発がん性のリスクも高くなる。そのため①食品中の汚染濃度を超高感度かつ即時の検出法の開発②AFM1が検出された食品に対するデトキシケーション③バイオマーカーによるアフラトキシンの曝露評価について検討する。①では昨年作成したモノクローナル抗体（#IF6）より高感度な２種類のモノクローナル抗体（#5A7,# 9H10）を作成し特異性、有機溶媒耐性を検討した。その結果#5A7のクローンが最も感度が高く、AFM1が0.07 ng/mLの濃度まで測定可能であることが明らかになった。②として、AFM1を吸着させる能力が高いといわれる乳酸菌を、乳製品および野菜から約100株分離し、それぞれのAFM1の吸着能を比較した。その結果植物から単離されたLactococcus lactisが動物性乳酸菌より多くのAFM1を捕獲することができる可能性が示唆された。
これらの成果は、最終年度において、最も感度の良い#5A7のVHとVLのシークエンスを解析し、それを利用して非競合ELISAであるオープンサンドイッチELISAの開発に供する。またAFM1を効率よく吸着する乳酸菌に対して、胃内、腸内環境でも結合能をin vitroで検討し、マウスを用いたin vivo吸収試験を行ってAMF1結合乳酸菌の体内動態を明らかにし、メカニズムが明らかである「デトキシケーション」食品の開発を目指す。③は①で確立したELISA法をマウスin vivo 実験で得られた尿、糞を用いて実証し、その有効性を検証する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究で開発するAFM1に対するモノクローナル抗体の特異性は、クローンにより左右される。現在モノクローナル抗体の維持を依頼している実験施設が熊本県益城町にあったことから、昨年の熊本地震でいままで維持していたクローンがすべて死滅してしまい、また作り直していたため、予定の実験計画が遅れてしまった。幸いに以前確立したクローンよりも感度、耐有機溶媒性の高いクローンを得ることができたので、このクローンをもとに食品中の汚染濃度を超高感度かつ即時の検出法の開発とバイオマーカーによるアフラトキシンの曝露評価用のELISAを確立する予定である。
一方デトキシケーションに対する検討は、順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度では、最も感度の良い#5A7のVHとVLのシークエンスを解析し、大腸菌に入れてVH-VLのみのペプチドを作成する。それを利用して非競合ELISAであるオープンサンドイッチELISAの開発を行う。
AFM1を効率よく吸着する乳酸菌５種を選び、胃内、腸内環境モデルをin vitroで作成して、これらの条件で結合が外れるかを検討する。その中で最も結合能が強かった株を１つ選んで、マウスにAFM1とともに摂取させ、血液中、尿中、糞中のAFM1濃度を①で開発したELISAで測定する。血液中のAFM1濃度が、乳酸菌非投与群に比べて優位に低ければ、乳酸菌のデトックス効果が実証される。また、糞中の濃度から腸管内でのAFM1乳酸菌の腸内動態を明らかにする。
これらのことにより、AFM1等の遺伝毒性をもつアフラトキシン類に汚染した食品を未然に高感度に検出すると同時に、摂取量をなるべく少なくするためにデトックスの効果を有する食品を開発する。本研究ではすでに野菜から分離された乳酸菌がデトックス効果を持つことがin vitro 実験で示唆されていることから,野菜の朝漬けなどの食品の開発が考えられる。さらにアフラトキシンの代謝産物を高感度で検出できるAFM1 ELISA法は、アフラトキシン類にどの程暴露されたかを知るためのバイオマーカー検出としても有効となり、この研究で構築した実験手法はシステマティックに遺伝毒性物質の摂取を抑える手法として貢献できる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度 連携研究者 上田 宏が、もっとも感度の高いモノクローナル抗体からVHとVLのシークエンスを解析する予定であったが、維持設備の事故によりモノクローナル抗体クローンを作り直したことから、研究進捗が遅れてしまい、最終年度となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
最終年度には#5A7モノクローナル抗体からVHとVLのシークエンスを解析し、その情報から非競合的ELISA であるオープンサンドイッチを試みる予定である。
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