| 研究課題/領域番号 |
15K07484
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
屋 宏典 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 教授 (10177165)
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| 研究分担者 |
稲福 征志 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 研究員 (90457458)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | イソプレン放出 / 調節機構 / 放出制御 / MEP経路 / 遺伝子発現 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、熱帯樹木の温度依存的なイソプレン放出のオン-オフ調節をモデルとして、その温度センシング及びシグナリング系を解明することである。初年度はイソプレン放出のリアルタイム分析システムを用いて、人工気象室内の温度を段階的に上下させた場合のオオバイヌビワ及びハマイヌビワの葉におけるイソプレン放出と光合成関連パラメーター及び基質供給系であるMEP経路の遺伝子発現及び中間代謝産物変動のプロファイリングを実施した。併せて、イソプレン合成酵素遺伝子の発現変動も解析した。MEP経路の遺伝子のうちDXS、MCT、CMKの発現は温度変化により有意に変動した。DXR、MCS、HDS、HDR、H.IDI遺伝子の発現には有意な変動は認められなかった。しかしながら、いずれの遺伝子発現についてもイソプレン放出との間に相関は認められなかった。一方、イソプレン合成酵素遺伝子発現及びイソプレン合成酵素タンパク質濃度はイソプレン放出と相関して変動した。MEP代謝経路の中間代謝産物のうち、DXP、MEcPDP、HMBDP、DMADP濃度は低温暴露後のイソプレン放出再開時に押しなべて上昇する傾向が認められたが、イソプレン放出とは相関しなかった。特にMEP経路の最終産物であり、イソプレン合成酵素の基質となるDMADP濃度は温度低下によるイソプレン放出停止時に高くなることがあきらかとなった。これらの結果は温度変化、特に低温適応時のイソプレン放出はMEP代謝経路の活性すなわち基質供給能力ではなく主にイソプレン合成酵素遺伝子の発現変動によって制御されていることを示唆するものと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請者等はイソプレン放出と光合成関連のパラメーターを同時にリアルタイムで計測できる分析システムを用いることにより、人工気象室内での条件としては12℃以下の温度でイソプレン放出が完全に停止し、これ以上の温度になると24時間以降にイソプレン放出が再開されることを既に見いだしている。
初年度はこの知見に基づき上述のリアルタイムの分析システムを用いて、人工気象室内の温度を段階的に上下させた場合のオオバイヌビワ及びハマイヌビワの葉におけるイソプレン放出と光合成関連パラメーター及び各種代謝関連酵素活性及び遺伝子発現変動のプロファイリングを実施する計画であった。光合成に関係するカルビン回路、エネルギー代謝に関係する解糖系及びクエン酸回路、葉緑体内における基質供給に直接的に関係すると考えられているMEP及びメバロン酸経路、イソプレノイド合成経路、及びイソプレン合成酵素実の遺伝子発現解析については計画実施できたが、酵素活性の測定については基質濃度の測定法の確立に時間を要したため実施できていない。28年度に実施予定のイソプレン合成酵素遺伝子の転写因子の解析と併せて補完実験を行う予定にしている。
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| 今後の研究の推進方策 |
28年度は、イソプレン合成酵素遺伝子のプロモーター活性の解析とこのプロモーター領域と各種転写因子のタンパク質相互作用等に関する情報を手がかりに温度変化とイソプレン放出制御に関わる転写因子及び関連制御因子群の絞り込みを行う。以下の研究を実施する。
イソプレン合成酵素プロモーター領域の解析
申請者はイソプレン合成酵素遺伝子の塩基配列を基にゲノムウォーキング法によりイソプレン合成酵素のプロモーター領域の塩基配列の決定を終えている。28年度は、このプロモーター領域をモデル植物シロイヌナズナへと導入して転写活性を解析する（この際、レポーター遺伝子を組み込んだコンストラクトの作成は当実験室で行うが、組み換植物の作成は外部業者に委託予定）。
パスウェイ可視化ツールによる温度センサーとシグナリング系の検索
シグナリングネットワークは相互に関連しており複雑であることから、上述の実験だけでは熱帯樹木の温度センサー及びシグナリング系の解明は困難が予想される。28年度は複数のデータベースを統合してネットワークを可視化するツール（Cytoscape）を併用することで、シロイヌナズナ等のモデル生物のデータベースについて転写因子をふくめたシグナリングネットワークの作成を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度はMEP経路の酵素活性を計測する計画であったが、LCMSを用いた酵素反応産物の計測条件の確立に想定以上の時間を要したため、酵素活性測定に使用予定の経費に残が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
28年度に実施予定のイソプレン合成酵素遺伝子の転写因子の解析と併せて、MEP経路の酵素活性の計測に使用予定である。
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