| 研究課題/領域番号 |
15K07504
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| 研究機関 | 宇都宮大学 |
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研究代表者 |
金野 尚武 宇都宮大学, 農学部, 准教授 (60549880)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | きのこ / 生体材料 / 応用微生物 / 糖 / バイオマス |
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| 研究実績の概要 |
きのこ類に含まれるβ-1,6グルカンは免疫活性化機能を持つ。しかしながら、きのこ類からの単離・精製は困難であるため、純粋なβ-1,6グルカンが得られた例はない。そこで本研究では純粋なβ-1,6グルカンを人工合成することを目的とした。平成27年度は、β-1,6グルカン分解酵素（グルカナーゼ）の合成酵素への変換を行った。スエヒロタケ（Schizophyllum commune）およびウシグソヒトヨタケ（Coprinopsis cinerea）由来のβ-1,6-グルカナーゼ（Sc30、Cc30）を本検討に用いた。類似酵素群とのマルチアライメントから、完全に保存されている２つのグルタミン酸、225番目と320番目（Sc30）、207番目と302番目（Cc30）のグルタミン酸が、それぞれ活性中心残基であると予想された。これらグルタミン酸をグリシンに置換したSc30Mu1（E225G）、Sc30Mu2（E320G）、Cc30Mu1（E207G）、Cc30Mu2（E302G）の４種のリコンビナントタンパク質をこうじ菌を用いて異種発現させ精製した。得られた酵素にはβ-1,6-グルカン分解活性が検出されなかったことから、これらグルタミン酸が活性中心残基であることが明らかになった。得られた酵素をそれぞれ100ｍM酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）、20ｍMフッ化ゲンチオビオース、20℃、48ｈの条件で反応させた。生成物を検出したところ、Sc30Mu2、Cc30Mu2において、２糖以上のオリゴ糖と多糖が検出でき、β-1,6-グルカンの合成に成功したと考えられた。現在、得られた生成物の構造解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
年次計画において、H27年度はβ-1,6グルカン合成酵素の獲得が課題であった。きのこ類（スエヒロタケおよびウシグソヒトヨタケ）由来のβ-1,6グルカナーゼを合成酵素への変換することに成功し、フッ化ゲンチオビオースを用いて糖転移活性を行うことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
きのこ類β-1,6-グルカナーゼの活性中心であるグルタミン酸をグリシンに置換したリコンビナントタンパク質を調製し、合成酵素へ変換できたが、β-1,6グルカン生成物の収率が当初の予定よりも低いことから、活性中心のアミノ酸をアラニン、セリンに置換した酵素を作製し、合成能を比較する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
β-1,6グルカン合成に必要な消耗品の購入を来年度に持ち越したため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
β-1,6グルカンおよび酵素分析用の消耗品、培地成分、オリゴ糖標品、電気泳動用試薬、タンパク精製用樹脂などを購入する。
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