| 研究課題/領域番号 |
15K07508
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
半 智史 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (40627709)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 心材形成 / 放射柔細胞 / 細胞死 / 自己分解酵素 / 形質転換体 / ショットガンプロテオーム解析 / 遺伝子発現解析 / ドロノキ |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、実験1：放射柔細胞の細胞死過程における発現タンパク質の網羅的解析、および実験2：放射柔細胞における自己分解酵素の蓄積および輸送に関する解析を行うことにより、樹木特有の長命細胞である放射柔細胞の独自の細胞死発現機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、前年度に実施したショットガンプロテオーム解析の結果より選抜された放射柔細胞の細胞死過程における自己分解に関与すると予想されるプロテアーゼの遺伝子発現パターンを中心に解析を行った。また、自己分解酵素を可視化するためのポプラ形質転換体の解析手法の検討を進めた。
ドロノキ（Populus suaveolens）樹幹より採取した試料を用いた。試料は採取後、直ちに液体窒素を用いて凍結させた。分化中の細胞を除くため当年形成木部を取り除いた。続いて、辺心材境界を確実に含むように、わずかに着色した部位を残して髄側を取り除いた辺材試料を得た。得られた試料を三分割して辺材外層、辺材中央部、辺材内層とし、さらにそれぞれを三分割して合計9個の試料を得た。各試料よりtotal RNAを抽出し、逆転写反応により1本鎖cDNAを合成し、自己分解に関わると予想されるプロテアーゼ遺伝子の発現パターンについてリアルタイムPCRによる解析を行った。その結果、今回解析した放射柔細胞の自己分解に関与すると予想されるプロテアーゼの辺材内層におけるタンパク質レベルでの蓄積は、遺伝子発現量の増加では説明できないことが明らかになった。
また、昨年度に作出した自己分解酵素を可視化するためのポプラ形質転換体について、目的の遺伝子が導入されていることを確認し、解析に十分な大きさになるまで育成を行った。これらの形質転換体を用いて、ライブイメージングを行うための解析について条件検討を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度では計画に沿った形で、放射柔細胞の細胞死を特徴付ける自己分解酵素の遺伝子発現パターンを明らかにすることにより、他の植物細胞におけるプログラム細胞死との違いをより明確にすることができた。また、自己分解酵素を可視化するためのポプラ形質転換体の育成を進め、放射柔細胞のライブイメージングを行う上で十分な大きさの個体を得ることが出来ており、現在は解析手法を検討中である。上記のように当初の計画を達成しているため、おおむね順調に進んでいると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
残りの研究期間において、放射柔細胞の細胞死を特徴付ける自己分解酵素の蓄積および輸送に関する以下の項目を中心に研究を進める予定である。
・ポプラ形質転換体を用いた自己分解酵素の動的挙動に関する解析：蛍光タンパク質と自己分解酵素を融合させたタンパク質を発現させたポプラ形質転換体の放射柔細胞について各種顕微鏡を用いて経時的解析を含めた詳細な観察を行う。
・インタクトな組織を用いた自己分解酵素の局在に関する解析：既知の細胞死関連の自己分解酵素あるいは実験１で選抜された細胞死に関与すると考えられる自己分解酵素の局在性について、各種顕微鏡で解析することで明らかにする。
以上、放射柔細胞における自己分解酵素の発現およびその挙動に着目した細胞生物学的研究を進めることで、樹木特有の長命細胞である放射柔細胞がもつ独自の細胞死発現機構を解明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度に予定していた局在解析の準備のために必要となる情報の精査およびデータの取得に時間をかける必要があると判断し、今年度は局在解析のための実験を行わなかったため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
必要な情報およびデータが揃い次第、局在解析のための実験を進める。
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