| 研究課題/領域番号 |
15K07569
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
長 由扶子 東北大学, 農学研究科, 助教 (60323086)
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| 研究分担者 |
日出間 志寿 東北大学, 農学研究科, 助教 (30241558)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 麻痺性貝毒生合成酵素 / 発現解析 / 抗ペプチド抗体 / 免疫染色 / LC-MSMS |
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| 研究実績の概要 |
【１．SxtA及びGの局在】本研究では麻痺性貝毒生合成の初期の反応を触媒すると予想されるタンパクSxtA4とSxtGの発現を渦鞭毛藻の免疫染色によって解析する方法を開発した。昨年度の結果からSxtA4はA. tamarense細胞内で特定のオルガネラに局在することが判明していたが、局在がより鮮明に検出されるようにプロトコールを改良した。オルガネラ特異的染色試薬を用いて、SxtA4の局在部位を調べた。同様に抗SxtG抗体でも染色し、その局在部位がSxtA4とは異なることを明らかにした。
【２．渦鞭毛藻の麻痺性貝毒及び生合成中間体の一斉分析法開発】カラムスイッチングと2段階グラジエントを組み合わせることで麻痺性貝毒の主要成分15種と生合成中間体3種及びシャント化合物1種の計19成分を渦鞭毛藻の粗抽出液から一斉に定量分析することが可能となった。本手法については国際学術雑誌に掲載され、国内学会にて報告した。
【３．渦鞭毛藻有毒種及び無毒種の生合成中間体とSxtA】A. tamarense以外の渦鞭毛藻におけるSxtAの発現と初期中間体の存在を確認するため、国内で麻痺性貝毒生産種として代表的な2種（Gymnodinium catenatumとAlexandrium catenella）及び非生産種としてAlexandrium属のA. insuetumと非Alexandrium属のProrocentrum triestinumを中間体及び麻痺性貝毒の一斉分析と免疫染色によるSxtA4発現解析に供した。2種の有毒種から推定生合成中間体であるInt-A’, Int-C’2、シャント化合物であるCyclic-C’及び抗SxtA4ペプチド抗体と反応するタンパクが検出され、無毒種からはいずれも検出されなかった。SxtA4タンパク発現と毒の生産能の関連性が示唆された。本成果は国内学会にて報告した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初の計画からは予期しなかった知見が得られ、それがさらに予想外の方向へと大きく進展したため。
【１．麻痺性貝毒生合成酵素の局在性の差異】免疫染色のプロトコールの改良により、生合成初期の反応を触媒するSxtA4タンパクの細胞質への漏出を抑制してよりオルガネラに収束した像を得ることに成功した。さらにその次の段階の反応を触媒する酵素SxtGの抗ペプチド抗体によっても免疫染色し、SxtA4とは異なる部位に存在することを初めて見出した。麻痺性貝毒の生合成の反応場が段階ごとに異なるのではないかということは我々が初めて提唱する説である。以前報告した代謝阻害剤コルヒチンによる毒生産抑制作用のメカニズムはこれまで全く不明であったが、今回得られた結果から生合成酵素が存在する小胞のリクルート阻害作用によるのではないかという新たな麻痺性貝毒生合成抑制機構を提唱することができた。
【２．カラムスイッチングHILIC-MS法による一斉分析法の開発】麻痺性貝毒とその生合成中間体は極性やチャージが異なるため、従来は一斉分析が困難であった。これまでは中間体用と麻痺性貝毒用の異なる前処理法を施した試料を別々に調製し、異なる手法で分析して定量分析する必要があった。今回渦鞭毛藻の粗抽出液から中間体と麻痺性貝毒が一斉定量分析可能となったことで、生合成研究が一段と迅速に遂行できるようになった。
【３．渦鞭毛藻有毒種及び無毒種の生合成中間体とSxtA】昨年度はA. tamarenseの有毒株と無毒株のみで比較していた。今年度はさらに別種の有毒種（A. catenellaとG. catenatum)と無毒種（A. insuetumとP. triestinum)においてもその麻痺性貝毒及び生合成中間体の存在とSxtA4タンパクの存在が一致するということを確認し、SxtA4タンパクの存在と毒生合成反応の進行の関連が示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
【１．渦鞭毛藻有毒種、無毒種の sxtA 遺伝子】コピー数：定量 PCR によって、毒組成の異なる有毒種 A.catenella, Gymnodinium catenatum、無毒種 A. insuetum、Prorocentrum triestinum各クローン株ゲノム中の sxtA 遺伝子のコピー数を決定し、有毒種と無毒種及び有毒種A. tamarense有毒株と無毒株のコピー数を比較する。3’UTR：これらの株の3'-raceによって変異 mRNA/ ntx-3’UTR が無毒株 UAT-014-009 特異的かどうかを明らかにする。
【２．SxtAとSxtGタンパクの構造解析】抗SxtA4ペプチド抗体及び抗SxtGペプチド抗体を固定したアフィニティビーズを作成し、渦鞭毛藻の有毒種、無毒種のタンパク抽出液からSxtA及びSxtGをそれぞれ濃縮し、SDS-PAGEで得られたスポットをIn gel digestionに供し、Maldi-TofMSにてPeptide mass fingerprintingで同定する。これにより、免疫染色で検出しているタンパクがsxtA及びsxtG遺伝子から転写翻訳されて生じたタンパクであることを証明する。
【３．免疫電顕によるSxtA局在オルガネラの同定】共焦点レーザー顕微鏡観察によるオルガネラ特異的蛍光染色色素でのSxtA局在部位の同定に困難が予想されるので、有毒渦鞭毛藻を包埋し切片を作成した後免疫電顕によりオルガネラを特定する。
【４．マイクロインジェクションによる RNA 導入基盤技術の開発 】GFPのRNAをIn vitro transcription で作成し、マイクロインジェクションで渦鞭毛藻A. tamarenseに注入後蛍光を観察することで、RNA 導入技術を確立する。
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