| 研究課題/領域番号 |
15K07574
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
増田 太郎 京都大学, 農学研究科, 助教 (40395653)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | フェノールオキシダーゼ / 甲殻類 / タイプ3銅蛋白質 / ヘモシアニン |
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| 研究実績の概要 |
平成28年度は、まず、申請者らがクルマエビ（クルマエビ科クルマエビ属）において見いだした血漿型新規フェノールオキシダーゼ(POb)の普遍性について検討した。具体的には、同属に属するサルエビより同様の酵素を精製し、PObが体液中の主たるフェノールオキシダーゼであることを明らかにした。更に、食用甲殻類として極めて重要なイセエビ（英名 ロブスター）の体液中のフェノールオキシダーゼ活性の本体についても検討した。その結果、イセエビ体液中では、血球型フェノールオキシダーゼ(POa)が活性の本体を担っていたものの、PObも共存していることが明らかになった。また、イセエビより精製した両POとも、体液中で同一サブユニットから成る6量体を形成しており、フェノールオキシダーゼの特性解析が進んでいる昆虫の場合とは大きく異なっていた。以上の結果から、食品として重要な十脚目の中でも、PO活性の主体は種によって異なっていると考えられた。
更に、クルマエビ、イセエビから精製したPObとPOaを用いて、その酵素学的について速度論的パラメータを算出し、他生物種由来のチロシナーゼ（フェノールオキシダーゼ）と比較した。その結果、甲殻類由来の両POは、よく知られている他の同類酵素より、基質に対する高い親和性と優れた触媒効率を有することが示された。
イセエビ由来のPOaについては、体液より精製した試料について、現在結晶化を試みている。また、フェノールオキシダーゼと極めて類似した活性中心を持ちながら、酵素活性を有さない甲殻類の酸素運搬蛋白質ヘモシアニンについて、昆虫細胞による蛋白質発現を行い、その機能解析を行う為の予備検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
甲殻類における黒変現象の主要な原因蛋白質として、従来から知られているフェノールオキシダーゼの他、新規な血漿型フェノールオキシダーゼであるPObを見いだし、その普遍性を明らかにすることが出来た。また、従来型(血球型・POa)と新規型（血漿型・POb）の寄与が、生物種によって異なる点も明らかにした。
他に、甲殻類黒変現象に寄与し得る因子として、POと同じ蛋白質ファミリー（タイプ3銅蛋白質）に属するヘモシアニンが挙げられている。申請者は、このヘモシアニンの構造と活性の相関を明らかにするため、生体からの精製法と組換え蛋白質の発現方法を検討しており、こちらも順調に推移している。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請者らの今年度の検討では、前出のヘモシアニンはフェノールオキシダーゼ活性を持ち得ないということが示唆されている。しかし、ヘモシアニンとフェノールオキシダーゼの二核の銅を含む活性中心の構造は、極めて類似している。この両者の活性の差異をもたらす構造的な要因を明らかにするため、フェノールオキシダーゼ、ヘモシアニンの立体構造解析、酵素反応速度論的解析を進める。
また、食品中におけるフェノールオキシダーゼの活性化に関する分子機構にも着目し、検討を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度は、主として実際の食用甲殻類試料からの蛋白質精製と機能解析を行った。試料についても、宅配で入手可能なものを扱ったため、旅費の出費は実験目的に限られた。実験についても、来る平成29年度の準備に当たるものが多く、次年度に研究費の使用が集中することとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度は、生体試料入手のため、サンプリングの旅費も必要となる。また、実験室での使用については、平成28年度にフェノールオキシダーゼ、ヘモシアニンといった本研究題目の対象となる蛋白質分子の発現系を構築し、平成29年度は実際の発現と精製に多大な費用が発生すると考えられる。
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