| 研究課題/領域番号 |
15K07576
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
筒井 直昭 岡山大学, 理学部, 助教 (00643785)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 甲殻類 / クルマエビ / 内分泌 / 卵黄形成 |
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| 研究実績の概要 |
クルマエビ卵巣のRNA-seq解析によって見出されたタンパク質ホルモン様分子の機能を明らかにするため、本年度は組換えタンパク質の作製を中心に研究を実施した。まず、甲殻類雌性ホルモン (CFSH)、ニューロパーシン (NPA)、甲殻類血糖上昇ホルモン族ペプチド (ovCHH) の全長cDNAをクローニングした。次に、各ホルモンがNusAタンパク質との融合体として得られるよう大腸菌発現用のプラスミドを構築した。これらのプラスミドを用いて大腸菌発現系においてタンパク質を産生させた結果、NPAとovCHHを含む融合タンパク質は菌破砕物の可溶性画分に大部分が回収された。一方CFSHについては不溶性画分に大部分が回収された。発現条件を検討したが、最良の条件でも可溶性画分への回収率はおおよそ50%であった。それぞれの融合タンパク質をNiアフィニティーカラムによる精製、酵素処理、逆相HPLCによる精製に供し、最終的に組換えホルモンを得ることができた。
また、NPAについては上記の組換えホルモンを抗原として、CFSHについては合成ペプチドを抗原として、それぞれ抗体を作製した。
加えて、この組換え体の作用を探るため、卵巣培養系における卵黄タンパク質前駆体遺伝子の発現に対する影響を調べた。CFSHとovCHHについては顕著な作用が観察されなかった。NPAについては遺伝子発現を変動させる可能性を示す結果が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
卵巣で発現しているタンパク質ホルモンのうち、NPAとovCHHについては大腸菌による大量発現系がほぼ構築できた。さらに組換えNPAを抗原とした抗体も作製した。一方でCFSHについては同様の方法で大量のタンパク質を得ることが難しいと判断されたため、別の方法を検討している。またこのことを受けて、合成ペプチドを抗原とした抗体を作製した。次年度以降、これらを用いた組織形態学的解析が可能となる。また、ホルモンの作用を検討するための卵巣培養実験も開始している。
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| 今後の研究の推進方策 |
まずovCHHに対する抗体を作製したのち、各ホルモンの局在解析を行う。併せて各ホルモン遺伝子の発現と成熟との関連を明らかにする。また、ホルモンの作用を検討するための組織培養実験を引き続き行うとともに、生体投与実験も開始する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
対象としているホルモン分子のうち1つについて抗体作製に至らなかったことと、発現タンパク質の精製に必要な什器・消耗品について一部所属研究室に備蓄されていたものを転用できたことによる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
未使用額は上述の抗体作製費用に充てるほか、次年度から行う生体投与実験において動物の購入費用が増加すると考えられるため、それにも充てる予定である。
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