| 研究課題/領域番号 |
15K07692
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
磯部 直樹 広島大学, 生物圏科学研究科, 准教授 (80284230)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 乳房炎 / 抗菌因子 / エストロゲン / 水チャネル |
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| 研究実績の概要 |
乳房炎による損害は国内で年間700億円以上であり，減少する兆しは全くない．したがって，乳房炎を防除することが酪農業界にとって急務である．乳房が黄色ブドウ球菌等に感染すると，細菌が組織に侵襲し，抗生物質の効果が弱まり慢性化する．このような慢性の難治性乳房炎が近年増えている．これらの乳房炎の治療は抗生物質を長期間用いる方法が主流であるが，牛乳の出荷ができず，耐性菌の出現も危惧される．したがって，抗生物質を使わない新たな治療法が期待される．そこで、抗菌因子に着目し、これを最大限に生かした治療法の確立を目指す。27年度はエストロゲン（E）が抗菌因子濃度に及ぼす影響について検討した。
In vivo 試験ではEを4日間筋中投与し，乳量及び乳汁成分を測定した。その結果、乳量がE投与により有意に減少した。乳中LAP濃度はEにより増加する傾向が認められた。
In vitro試験において，牛乳から乳腺上皮細胞を単離し、Eを種々の濃度添加した培地で培養し，培地は抗菌因子の濃度を、上皮細胞は抗菌因子、水輸送蛋白であるアクアポリン、密着結合分子の遺伝子発現を調べた．その結果、培地にEを添加するとアクアポリン７および密着結合分子であるClaudin-1、6のmRNA発現が有意に減少したが、抗菌因子であるLAPやTAPの発現や培地中の濃度は減少しなかった。
以上の結果から、Eによって水チャネル分子および密着結合分子の減少により、乳量が低下し、それによって乳中抗菌因子の濃度が増加すると推察された。したがって、Eを利用することにより乳房炎の予防・治療の可能性が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
In vitro試験において，牛乳から直接乳腺上皮細胞を単離する方法を用い、これを増殖してE試験に用いた。Eを種々の濃度添加した培地で培養し，経時的に培地および細胞を採取した。培地は乳糖，乳蛋白，乳脂質および抗菌因子の濃度を測定し，細胞は全RNAを採取した後，定量PCRを行い，抗菌因子，水輸送蛋白であるアクアポリンおよび密着結合分子の発現を調べた。これらは計画書に記載した通りの内容であり、計画通り実験が遂行されたと判断できる。
In vivo 試験ではEを種々の日数筋中投与し，経時的に乳汁を採取した。乳汁は乳糖，乳蛋白，乳脂質および抗菌因子の濃度を測定した。これらは計画書通りの内容であった。しかし、E投与の後バイオプシーによって組織を採取する予定であったが、ウシの乳房からバイオプシーをすることが不可能であったため、実施できなかった。しかし、ヤギを用いた試験に切り替えて、同内容の試験を実施する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
抗菌因子の発現を増強させ乳中の抗菌因子の濃度を増加させるためのもう一つの手法として，細菌成分を乳房に投与する方法を試験する。サプリメントとして広く普及しているため安全性にも問題のないプロバイオティクスを経口投与することにより消化管抗菌因子の遺伝子発現が増加することが知られているので、本試験ではこのプロバイオティクスを乳房内に直接投与して、乳汁中の抗菌因子の濃度変化を調べる。
プロバイオティクスを乳頭経由で乳腺に注入した後，経時的に乳サンプルを採取するとともにバイオプシーにより乳腺組織を採取する。乳サンプルの測定項目およびPCRのターゲット遺伝子は抗菌因子（lingual antimicrobial peptide;LAP, S100A7, lactoferrin, cathelicidin, lactoperoxidase）等である。抗菌因子の測定方法は酵素免疫測定法を用いる予定であり，これらの手法はすでに確立している。炎症の程度を調べるために体細胞数（somatic cell count: SCC）も調べる．プロバイオティクスはまず酵母を試す予定である。もし、予定通りの結果が得られない場合、他の枯草菌，乳酸菌，糖化菌，ビフィズス菌，酪酸菌等の利用に切り替え，抗菌因子合成・分泌に最適なものを絞り込む。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
in vivo試験において、Eを投与した後の乳腺組織をバイオプシーで採取する試験を実施できなかったことが理由と考えている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記のバイオプシー試験を実施するとともに、次段階のプロバイオティクス投与試験を両方実施する予定のため、これらの試験に必要な試薬や消耗品の購入に充てる。
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