独自システムによるホモKOマイクロミニブタ細胞の効率的濃縮とその応用

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K07695
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 佐藤 正宏 鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 教授 (30287099)
• 研究分担者: 三好 和睦 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 教授 (70363611)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: マイクロミニブタ / 胎仔性繊維芽細胞 / CRISPR/Cas9 / ゲノム編集 / targeted toxin / LDLR / 動脈硬化 / 体細胞核移植

研究実績の概要

本研究課題では、最近開発された次世代型ノックアウト（KO）と呼ばれるCRISPR/Cas9などのゲノム編集技術を用いてブタ（マイクロミニブタ）胎仔由来の繊維芽細胞（MPEF）ゲノム内の特定遺伝子（異種移植関連遺伝子alpha-1,3-galactosyltransferase [alpha-GalT]や動脈硬化責任遺伝子low density lipoprotein receptor [LDLR]）を完全に破壊し、我々がこれまでに独自に開発したKO細胞のみを効率的に濃縮する系（targeted toxin-based selection）を用いて遺伝子改変MPEF株を作製し、最終的にその細胞をドナーとする体細胞核移植によるクローン個体作製、それによる動脈硬化モデルブタ作製を試みる。平成２7年度ではMPEFから遺伝子改変細胞株取得を行った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

alpha-GalT, LDLR遺伝子のKOを行い、得られた株の約30%はdouble ホモKO、約60%はalpha-GalTホモKO/LDLRヘテロKOという良好な成績を得た。

今後の研究の推進方策

平成28度では、平成27度に得られたdouble ホモKO MPEF株をドナーとする体細胞核移植を行い、移植胚のレシピエントメスブタ（産業ブタ）への移植によるクローンブタ個体作製を行う。一方で、体細胞核移植された胚（胚盤胞）を用いて、当該胚を構成する細胞がdouble ホモKOの特性を有するかを分子生物学的、免疫組織化学的に検討する。

研究成果

• [雑誌論文] Preincubation with green tea polyphenol extract is beneficial for attenuating sperm injury caused by freezing-thawing in swine. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kitaji H, Ookutsu S, Sato M, Miyoshi K
  • 雑誌名: Animal Science Journal 巻: 86 ページ: 922-928
  • DOI: 10.1111/asj.12379
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Therapeutic angiogenesis for limb ischemia by using angiogenic growth factors and carriers. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakamura S, Sato M, Hattori H, Shimizu M, Fujita M, Maehara T, Ishihara M
  • 雑誌名: Current Tissue Engineering 巻: 4 ページ: 57-63
  • DOI: 10.2174/2211542004666150605000901
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). (2015)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuka M, Miura H, Mochida K, Hirose M, Hasegawa A, Ogura A, Mizutani R, Kimura M, Isotani A, Ikawa M, Sato M、Gurumurthy CB
  • 雑誌名: BMC Genomics 巻: 16 ページ: 274
  • DOI: 10.1186/s12864-015-1432-5
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] PiggyBac transposon-mediated gene delivery efficiently generates stable transfectants derived from cultured primary human deciduous tooth dental pulp cells (HDDPCs) and HDDPC-derived iPS cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Inada E, Saito I, Watanabe S, Aoki R, Miura H, Ohtsuka M, Murakami T, Sawami T, Yamasaki Y, Sato M
  • 雑誌名: International Journal of Oral Science 巻: 7 ページ: 144-145
  • DOI: 10.1038/ijos.2015.18
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9n-Mediated Deletion of the Snail 1Gene (SNAI1) Reveals Its Role in Regulating Cell Morphology, Cell-Cell Interactions, and Gene Expression in Ovarian Cancer (RMG-1) Cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Haraguchi M, Sato M, Ozawa M
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 10 ページ: e0132260
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0132260
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Generation of α-1,3-galactosyltransferase-deficient porcine embryonic fibroblasts by CRISPR/Cas9-mediated knock-in of a small mutated sequence and a targeted toxin-based selection system. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Kagoshima A, Saitoh I, Inada E, Miyoshi K, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S
  • 雑誌名: Domestic Animal Reproduction 巻: 50 ページ: 872-880
  • DOI: 10.1111/rda.12565
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] GONAD: Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery system: a novel microinjection independent genome engineering method in mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takahashi G, Gurumurthy CB, Wada K, Miura H, Sato M, Ohtsuka M
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 ページ: 11406
  • DOI: 10.1038/srep11406
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Choice of feeders is important when first establishing iPSCs derived from primarily cultured human deciduous tooth dental pulp cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Saitoh I, Inada E, Iwase Y, Noguchi H, Murakami T, Soda M, Kubota N, Hasegawa H, Akasaka E, Matsumoto Y, Oka K, Yamasaki Y, Hayasaki H, Sato M
  • 雑誌名: Cell Medicine 巻: 8 ページ: 9-23
  • DOI: 10.3727/215517915X689038
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of a functional PRSS1 promoter variant in linkage disequilibrium with the chronic pancreatitis-protecting rs10273639. (2015)
  • 著者名/発表者名: Boulling A, Sato M, Masson E, Génin E, Chen JM, Férec C
  • 雑誌名: Gut 巻: 64 ページ: 1837-1838
  • DOI: 10.1136/gutjnl-2015-310254
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. (2015)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Gurumurthy CB, Sato T, Sato M, Ohtsuka M
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 ページ: 12799
  • DOI: 10.1038/srep12799
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Direct injection of CRISPR/Cas9-related mRNA into cytoplasm of parthenogenetically activated porcine oocytes causes frequent mosaicism for indel mutations. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Koriyama M, Watanabe S, Ohtsuka M, Sakurai T, Inada E, Saitoh I, Nakamura S, Miyoshi K
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences, 巻: 16 ページ: 17838-17856
  • DOI: 10.3390/ijms160817838
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Assessment of artificial miRNA architectures for higher knockdown efficiencies without the undesired effects in mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Inoko H, Tanaka M, Nakaoka H, Kimura M, Gurumurthy CB, Sato M, Ohtsuka M
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 10 ページ: e0135919
  • DOI: 10.1371/journal.pone
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] zygote injectionに依らない生殖細胞、胚を標的とした遺伝子導入によるCRISPR/Cas9 genome editingの可能性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 佐藤正宏, 大塚正人, 中村伸吾, 桜井敬之, 稲田絵美, 齋藤一誠, 渡部聡
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] CRISPR/Cas9系を用いた新規ノックダウンマウス作製法の開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 三浦浩美, 佐藤正宏, GURUMURTHY Channabasavaiah, 大塚正人
  • 学会等名: 第108回日本繁殖生物学会大会
  • 発表場所: 宮崎大学木花キャンパス（宮崎県・宮崎市）
  • 年月日: 2015-09-17 – 2015-09-20
• [学会発表] GONAD：採卵，顕微注入，移植を要しない新規ゲノム編集マウス作製法 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大塚正人, GURUMURTHY Channabasavaiah, 三浦浩美, 佐藤正宏, 和田健太, 高橋剛:
  • 学会等名: 第108回日本繁殖生物学会大会
  • 発表場所: 宮崎大学木花キャンパス（宮崎県・宮崎市）
  • 年月日: 2015-09-17 – 2015-09-20
• [学会発表] ブタ単為発生卵細胞質へのCRISPR/Cas9系mRNAの直接顕微注入によるゲノム編集は多様な標的遺伝子変異を持つ細胞を生む (2015)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 正宏, 郡山 実優, 渡部 聡, 大塚 正人, 桜井 敬之, 稲田 絵美, 齋藤 一誠, 中村 伸吾, 三好 和睦
  • 学会等名: 第108回日本繁殖生物学会大会
  • 発表場所: 宮崎大学木花キャンパス（宮崎県・宮崎市）
  • 年月日: 2015-09-17 – 2015-09-20
• [学会発表] マウス受精卵への顕微注入を介したターゲットトラ ンスジェネシス法の改良 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大塚正人、三浦浩美、佐藤正宏、木村穣
  • 学会等名: 第62回実験動物学会総会
  • 発表場所: 京都テルサ（京都市）
  • 年月日: 2015-05-28 – 2015-05-30
• [学会発表] 人工miRNAを用いたマウス遺伝子ノックダウンシステムの検証 (2015)
  • 著者名/発表者名: 三浦浩美、木村穣、佐藤正宏、大塚正人
  • 学会等名: 第62回実験動物学会総会
  • 発表場所: 京都テルサ（京都市）
  • 年月日: 2015-05-28 – 2015-05-30
• [学会発表] 卵管を介したマウス2細胞期胚へのRNA導入法の開発とゲノム編集技術への応用 (2015)
  • 著者名/発表者名: 高橋剛、和田健太、三浦浩美、佐藤正宏、大塚正人
  • 学会等名: 第62回実験動物学会総会
  • 発表場所: 京都テルサ（京都市）
  • 年月日: 2015-05-28 – 2015-05-30