| 研究課題/領域番号 |
15K07717
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
有川 二郎 北海道大学, 医学研究科, 教授 (10142704)
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| 研究分担者 |
土佐 紀子 北海道大学, 医学研究科, 助教 (20312415)
高倉 彰 公益財団法人実験動物中央研究所, 事業部門, 部門長 (60167484)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | イムノクロマト / 実験動物 / モニタリング / 人獣共通感染症 / 動物由来感染症 / 血清診断 |
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| 研究実績の概要 |
近年の遺伝子改変動物（Tg, KOマウス、ラット）使用実験の爆発的増加により、実験動物の感染症予防における獣医学的管理の重要性がますます高まっている。それに伴い実験動物の微生物統御方法の問題点が明らかになってきている。すなわち、少数多系統の遺伝子改変動物の微生物統御が必要となった。また、マイクロアイソレーター飼育により、従来の「おとり動物」を検査することでは該当系統の動物の感染の有無を検出することができなくなった。このため、安楽死させることなく、対象動物の個体毎に「抗体検査」する微量全血・高感度診断法の開発が必要である。
本研究では、微量全血を用いてマウスおよびラットやマウス等の実験動物の主要感染症を同時に検査出来る「多項目（マルチプレックス）イムノクロマト法」の開発と実用化を目的として初年度（平成２７年度）においてはラット血清を対象として研究を実施した。
2年度（平成28年度）については、１マウスの感染症としてマウス肝炎、センダイウイルス感染症、ティザー病、マイコプラズマ感染症を選択し、それぞれの病原体に対する免疫血清を準備した。２上記感染症病原体の菌体抽出抗原もしくは固定ウイルス粒子を準備した。３マウスIgG検出のためにProtein A標識金コロイド粒子を用いた。４上記抗原、免疫血清および金コロイド粒子を用いて、マウスIgG検出イムノクロマト法テストストリップを作成した。５使用抗原濃度、金コロイド粒子濃度の調整を行い、上記疾患それぞれの陽性コントロール血清において、抗体を検出出来る事を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
検出対象としたマウスの主要感染症は、マウス肝炎（MHV）、センダイウイルス感染症（HVJ）、ティザー病（Tyzzer）、およびマイコプラズマ感染症（Myco）の4種類とした。各感染症の抗原および陽性血清は、実験動物中央研究所にて作製しELISAキットで使用されているものを用いた。ICG法におけるマウスIgG抗体の検出担体にはProtein A（ナカライ）標識金コロイド粒子（WRGH2、ワインレッドケミカル）を使用し、各陽性血清を50倍、100倍、200倍、および各抗原を1倍、10倍、100倍まで3段階に希釈しイムノクロマト法を実施した。
各感染症の陽性血清を200倍希釈でスクリーニングしたところ、MHVで0.5mg/ml 、HVJでは0.5mg/ml、Tyzzerでは0.6mg/mlの抗原濃度において、コントロールラインと同程度の強さの反応が得られた。一方、同じ希釈倍率の正常ラット血清ではいずれの抗原においても反応は認められなかった。Mycoは0.8mg/mlの抗原濃度において、各希釈倍率の陽性血清のいずれにおいても、弱い反応しか得られず、同じ希釈倍率の正常ラット血清においても反応は認められなかった。
以上の成績から、本ICG法はMHV、HVJおよびTyzeerの3種類のマウスの主要感染症の診断に有用と考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウスの主要感染症の診断については、以下の研究を実施する。
1. Mycoに関しては、検出単体に関して抗マウスIgGウサギ抗体標識金コロイド粒子等を検討する。2.リンパ球性脈絡髄膜炎（LVMV）上記感染症病原体の組換え抗原もしくは固定ウイルス粒子を準備する。3.多数検体を用いた感度・特異性を検討する。4.既存のELISA法との感度の比較を行う。5.単一のICG上に5種類の抗原を塗布する多項目ICG法の開発を進める。
ラットの主要感染症の診断については、多数検体を用いた感度・特異性の検討ならびに既存のELISA法との感度の比較を行う。さらに、単一のICG上に5種類の抗原を塗布する多項目ICG法の開発を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度は、マウスに感染する実験動物由来人獣共通感染症及びマウスの主要感染症を対象とするモニタリング用イムノクロマト法の開発を目的として実施した。しかし、該当する疾患のうち、マイコプラズマ症について、用いたいずれの抗原濃度においても、また、試みた免疫血清において、陽性の成績を得ることができなかった。使用抗原の種類、濃度が不十分である可能性がある。このため、マイコプラズマ症検出法を評価するために当初予定した多数のイムノクロマト法試験キットの作成を行うことが平成２８年度中に実施出来なかった。また、診断が出来ないため、マイコプラズマ症の診断のための陽性血清の収集を行わなかった。このため、物品費等の使用額が当初予定よりも少なく、予算の執行が見積もり通りに完了しなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
速やかに、マイコプラズマ症の新たな診断抗原の作成と高感度免疫血清の作成を開始する。このために、マイコプラズマ菌の培養と精製のための物品費が必要となる。感度・特異性検定のため、多数のテストストリップを作成する。さらに、マイコプラズマ症診断のためのマウス血清の収集に努める。このため、実験用動物の飼育代、血清集取のための旅費、抗原、免疫血清及びテストストリップ作成のために試薬代が必要になる。
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